[发明专利]基于唾液蛋白质组学的肝癌肝郁证生物标志物检测的方法

摘要

本发明公开了基于唾液蛋白质组学的肝癌肝郁证生物标志物检测的方法，具体步骤如下：样品蛋白提取；采用Brad ford法测定提取的蛋白浓度；蛋白酶解；iTRAQ标记；真空冷冻离心干燥；高pH条件下的反相色谱分离；ABI‑5600进行蛋白质分析；质谱数据分析：在选择数据库时，若为已经测序生物，直接选用该物种数据库，若为非测序生物，则选择与被测样品最为相关的大类蛋白质组数据库；采用ABI‑5600型质谱仪进行iTRAQ的质谱分析。本发明能够快速、可靠的蛋白质组学技术方案来发现肝癌肝郁证中的特异性蛋白标记物，为肝癌肝郁证早期诊治、术后复发、转移及预后观察建立一种无创、简便、快捷实用的检测评估手段。

主权项

1.基于唾液蛋白质组学的肝癌肝郁证生物标志物检测的方法，其特征在于，具体步骤如下：(1)样品蛋白提取：样本中加入5％的裂解缓冲液进行涡旋混匀，超声60s，振幅22％室温提取30min；15000r/min、4℃离心20min，取出上清；收集上清，分装分装后冻存于‑80℃；(2)蛋白定量：采用Bradford法测定提取的蛋白浓度，先将样本用裂解缓冲液进行一定倍数稀释使其终浓度落在标曲范围内，稀释好的样本和标准品各取10μl分别和300μl蛋白定量染料避光反应20min，用酶标仪同时测定标准品和样本在595nm下的吸光值，根据标准品每管吸光值和浓度的关系绘制标准曲线，根据曲线公式计算各样品蛋白浓度；(3)蛋白酶解：蛋白定量后取200μg蛋白溶液置于离心管中；加入4μl还原剂，60℃反应1h；加入2μl的半胱氨酸阻断剂，室温反应10min；将还原烷基化后的蛋白溶液加入10K的超滤管中，12000r/min离心20min，弃掉收集管底部溶液；加入iTRAQ试剂盒中的溶液缓冲液100μl，12000转离心20min，弃掉收集管底部溶液，重复3次；更换新的收集管，在超滤管中加入胰蛋白酶，总量4μg，体积50μl，37℃反应过夜；次日，12000r/min离心20min，酶解消化后的肽段溶液离心于收集管底部；在超滤管中加入50μl溶解缓冲液，12000r/min再次离心20min，与上步合并，收集管底部共得到100μl酶解后的样品；(4)iTRAQ标记：从冰箱中取出iTRAQ试剂，平衡到室温，将iTRAQ试剂离心至管底；向每管iTRAQ试剂中加入150μl异丙醇，涡旋振荡，离心至管底；取50μl酶解后的样品转移到新的离心管中；将iTRAQ试剂添加到样品中，涡旋振荡，离心至管底，室温反应2h；加入100μl水终止反应；从4组样品中各取出1ul混合，用Ziptip脱盐后进行MALDI‑TOF‑TOF鉴定，确认标记反应良好；混合标记后的样品，涡旋振荡，离心至管底；真空冷冻离心干燥；抽干后的样品冷冻保存待用；(5)高pH条件下的反相色谱分离：所需试剂的调配：流动相A：98％ddH2O，2％乙腈，pH10；流动相B：98％乙腈，2％ddH2O，pH10；ddH2O用氨水调pH值到10；混合标记后的样品用100ul流动相A溶解，14000r/min离心20min，取上清待用；使用400μg酶解好的BSA进行分离，检测系统情况；取100ul准备好的样本上样；流速0.7ml/min，得到分离梯度数据；(6)ABI‑5600进行蛋白质分析：所需试剂的调配：流动相A：100％超纯水，0.1％甲酸；流动相B：100％乙腈，0.1％甲酸；将高pH反相分离得到的组份用20μl2％甲醇，0.1％甲酸复溶；12000r/min离心10min，吸取上清上样，上样体积10μl，采取夹心法上样；装载泵流速350nl/min，15min；分离流速350nl/min，得到分离梯度数据；(7)质谱数据分析：在选择数据库时，若为已经测序生物，直接选用该物种数据库，若为非测序生物，则选择与被测样品最为相关的大类蛋白质组数据库；采用ABI‑5600型质谱仪进行iTRAQ的质谱分析；(8)检测结果：对肝癌肝郁证和正常对照组进行对比实验，定量蛋白质组学研究结果显示：鉴定1297个蛋白；与正常对照组相比，肝癌肝郁证中鉴定到的1.5倍以上表达差异的显著差异蛋白共140个，其中上调蛋白64个，下调蛋白76个；差异蛋白列表如下：上调蛋白如下：1)检索号为Q9Y661，基因注释为Heparan sulfate glucosamine 3‑O‑sulfotransferase 4；2)检索号为Q66K66，基因注释为Transmembrane protein 198；3)检索号为P11684，基因注释为Uteroglobin；4)检索号为P0CG06，基因注释为Ig lambda‑3 chain C regions；5)检索号为P0CG39，基因注释为POTE ankyrin domain family member J；6)检索号为Q6ZUA9，基因注释为Maestro heat‑like repeat family member 5；7)检索号为P31949，基因注释为Protein S100‑A11；8)检索号为O60635，基因注释为Tetraspanin‑1；9)检索号为P01764，基因注释为Ig heavy chain V‑III region 23；10)检索号为P54687，基因注释为Branched‑chain‑amino‑acid aminotransferase,cytosolic；11)检索号为P01743，基因注释为Ig heavy chain V‑I region HG3；12)检索号为P04632，基因注释为Calpain small subunit 1；13)检索号为Q9NPC1，基因注释为Leukotriene B4 receptor 2；14)检索号为Q9BPV8，基因注释为P2Y purinoceptor 13；15)检索号为Q8IZF2，基因注释为Probable G‑protein coupled receptor 116；16)检索号为P42126，基因注释为Enoyl‑CoA delta isomerase 1,mitochondrial；17)检索号为P08637，基因注释为Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III‑A；18)检索号为P83593，基因注释为Ig kappa chain V‑IV region STH(Fragment)；19)检索号为P04179，基因注释为Superoxide dismutase[Mn],mitochondrial；20)检索号为P49221，基因注释为Protein‑glutamine gamma‑glutamyltransferase 4；21)检索号为Q8NDA2，基因注释为Hemicentin‑2；22)检索号为Q96JC1，基因注释为Vam6/Vps39‑like protein；23)检索号为P41439，基因注释为Folate receptor gamma；24)检索号为P01877，基因注释为Ig alpha‑2 chain C region；25)检索号为Q96L46，基因注释为Calpain small subunit 2；26)检索号为P01876，基因注释为Ig alpha‑1 chain C region；27)检索号为P05109，基因注释为Protein S100‑A8；28)检索号为P06702，基因注释为Protein S100‑A9；29)检索号为P46939，基因注释为Utrophin；30)检索号为P01624，基因注释为Ig kappa chain V‑III region POM；31)检索号为Q14508，基因注释为WAP four‑disulfide core domain protein 2；32)检索号为P04181，基因注释为Ornithine aminotransferase,mitochondrial；33)检索号为O95274，基因注释为Ly6/PLAUR domain‑containing protein 3；34)检索号为P01040，基因注释为Cystatin‑A；35)检索号为P01834，基因注释为Ig kappa chain C region；36)检索号为P08118，基因注释为Beta‑microseminoprotein；37)检索号为P01598，基因注释为Ig kappa chain V‑I region EU；38)检索号为Q9UGM3，基因注释为Deleted in malignant brain tumors 1 protein；39)检索号为P22532，基因注释为Small proline‑rich protein 2D；40)检索号为P01623，基因注释为Ig kappa chain V‑III region WOL；41)检索号为P30048，基因注释为Thioredoxin‑dependent peroxide reductase,mitochondrial；42)检索号为P15328，基因注释为Folate receptor alpha；43)检索号为P03973，基因注释为Antileukoproteinase；44)检索号为P01770，基因注释为Ig heavy chain V‑III region NIE；45)检索号为P13473，基因注释为Lysosome‑associated membrane glycoprotein 2；46)检索号为Q6P995，基因注释为Protein FAM171B；47)检索号为Q6UW32，基因注释为Insulin growth factor‑like family member 1；48)检索号为P22528，基因注释为Cornifin‑B；49)检索号为P29034，基因注释为Protein S100‑A2；50)检索号为P35326，基因注释为Small proline‑rich protein 2A；51)检索号为Q5JS37，基因注释为NHL repeat‑containing protein 3；52)检索号为Q9NRK6，基因注释为ATP‑binding cassette sub‑family B member 10,mitochondrial；53)检索号为O95497，基因注释为Pantetheinase；54)检索号为Q9GZN4，基因注释为Brain‑specific serine protease 4；55)检索号为P61626，基因注释为Lysozyme C；56)检索号为Q12792，基因注释为Twinfilin‑1；57)检索号为Q96HE7，基因注释为ERO1‑like protein alpha；60)检索号为P00738，基因注释为Haptoglobin；61)检索号为P59665，基因注释为Neutrophil defensin 1；62)检索号为P80419，基因注释为Ig heavy chain V‑III region GAR；63)检索号为O00755，基因注释为Protein Wnt‑7a；64)检索号为P36222，基因注释为Chitinase‑3‑like protein 1；65)检索号为A8K2U0，基因注释为Alpha‑2‑macroglobulin‑like protein 1；66)检索号为P02788，基因注释为Lactotransferrin；下调蛋白如下：1)检索号为P15374，基因注释为Ubiquitin carboxyl‑terminal hydrolase isozyme L3；2)检索号为Q15493，基因注释为Regucalcin；3)检索号为O95716，基因注释为Ras‑related protein Rab‑3D；4)检索号为Q7Z5M8，基因注释为Abhydrolase domain‑containing protein 12B；5)检索号为P08571，基因注释为Monocyte differentiation antigen CD14；6)检索号为Q9P0M2，基因注释为A‑kinase anchor protein 7isoform gamma；7)检索号为Q9BYB0，基因注释为SH3 and multiple ankyrin repeat domains protein 3；8)检索号为P02652，基因注释为Apolipoprotein A‑II；9)检索号为P00533，基因注释为Epidermal growth factor receptor；10)检索号为Q9H7L9，基因注释为Sin3 histone deacetylase corepressor complex component SDS3；11)检索号为P58499，基因注释为Protein FAM3B；12)检索号为Q9UHY1，基因注释为Nuclear receptor‑binding protein；13)检索号为O60888，基因注释为Protein CutA；14)检索号为P08833，基因注释为Insulin‑like growth factor‑binding protein 1；15)检索号为Q14289，基因注释为Protein‑tyrosine kinase 2‑beta；16)检索号为Q9GZZ8，基因注释为Extracellular glycoprotein lacritin；17)检索号为P61956，基因注释为Small ubiquitin‑related modifier 2；18)检索号为P35908，基因注释为Keratin,type II cytoskeletal 2 epidermal；19)检索号为Q16378，基因注释为Proline‑rich protein 4；20)检索号为P22626，基因注释为Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins A2/B1；21)检索号为Q9HCU9，基因注释为Breast cancer metastasis‑suppressor 1；22)检索号为Q15942，基因注释为Zyxin；23)检索号为O43852，基因注释为Calumenin；24)检索号为P02654，基因注释为Apolipoprotein C‑I；25)检索号为P16870，基因注释为Carboxypeptidase E；26)检索号为Q13185，基因注释为Chromobox protein homolog 3；27)检索号为P39687，基因注释为Acidic leucine‑rich nuclear phosphoprotein 32 family member A；28)检索号为P23381，基因注释为Tryptophan‑‑tRNA ligase,cytoplasmic；29)检索号为Q86VR7，基因注释为V‑set and immunoglobulin domain‑containing protein 10‑like；30)检索号为Q9HCF6，基因注释为Transient receptor potential cation channel subfamily M member 3；31)检索号为Q0VD83，基因注释为Apolipoprotein B receptor；32)检索号为Q9NYL9，基因注释为Tropomodulin‑3；33)检索号为Q9GZR7，基因注释为ATP‑dependent RNA helicase DDX24；34)检索号为Q15293，基因注释为Reticulocalbin‑1；35)检索号为Q8N4F0，基因注释为BPI fold‑containing family B member 2；36)检索号为Q8NI35，基因注释为InaD‑like protein；37)检索号为Q14118，基因注释为Dystroglycan；38)检索号为P35237，基因注释为Serpin B6；39)检索号为P80303，基因注释为Nucleobindin‑2；40)检索号为P30046，基因注释为D‑dopachrome decarboxylase；41)检索号为P07711，基因注释为Cathepsin L1；42)检索号为Q9Y490，基因注释为Talin‑1；43)检索号为Q02818，基因注释为Nucleobindin‑1；44)检索号为P01034，基因注释为Cystatin‑C；45)检索号为Q04917，基因注释为14‑3‑3protein eta；46)检索号为P04264，基因注释为Keratin,type II cytoskeletal 1；47)检索号为Q15121，基因注释为Astrocytic phosphoprotein PEA‑15；48)检索号为Q8WVQ1，基因注释为Soluble calcium‑activated nucleotidase 1；49)检索号为P27169，基因注释为Serum paraoxonase/arylesterase 1；50)检索号为Q96CX2，基因注释为BTB/POZ domain‑containing protein KCTD12；51)检索号为Q9BRZ2，基因注释为E3 ubiquitin‑protein ligase TRIM56；52)检索号为Q6BCY4，基因注释为NADH‑cytochrome b5 reductase 2；53)检索号为Q9Y4L1，基因注释为Hypoxia up‑regulated protein 1；54)检索号为Q9BRK5，基因注释为45 kDa calcium‑binding protein；55)检索号为P42768，基因注释为Wiskott‑Aldrich syndrome protein；56)检索号为P02808，基因注释为Statherin；57)检索号为P30085，基因注释为UMP‑CMP kinase；60)检索号为O15050，基因注释为TPR and ankyrin repeat‑containing protein 1；61)检索号为Q8NI51，基因注释为Transcriptional repressor CTCFL；62)检索号为P01036，基因注释为Cystatin‑S；63)检索号为P12109，基因注释为Collagen alpha‑1(VI)chain；64)检索号为P05154，基因注释为Plasma serine protease inhibitor；65)检索号为Q96FV2，基因注释为Secernin‑2；66)检索号为P23280，基因注释为Carbonic anhydrase 6；67)检索号为P63279，基因注释为SUMO‑conjugating enzyme UBC9；68)检索号为P13645，基因注释为Keratin,type I cytoskeletal 10；69)检索号为P01037，基因注释为Cystatin‑SN；70)检索号为O75792，基因注释为Ribonuclease H2 subunit A；71)检索号为Q9GZM5，基因注释为Protein YIPF3；72)检索号为P15515，基因注释为Histatin‑1；73)检索号为P02814，基因注释为Submaxillary gland androgen‑regulated protein 3B；74)检索号为Q96P44，基因注释为Collagen alpha‑1(XXI)chain；75)检索号为Q8TF64，基因注释为PDZ domain‑containing protein GIPC3；76)检索号为Q9Y4Y9，基因注释为U6snRNA‑associated Sm‑like protein LSm5；77)检索号为Q13217，基因注释为DnaJ homolog subfamily C member 3；78)检索号为Q99574，基因注释为Neuroserpin。