[发明专利]一种发现和鉴定肝癌血清差异表达蛋白和验证标志物蛋白方法

摘要

本发明公开了一种发现和鉴定肝癌血清差异表达蛋白和验证标志物蛋白方法,利用iTRAQ标记结合MALDI－TOF MS/MS技术，发现和鉴定肝癌血清差异表达蛋白，MRM验证标志物蛋白；本发明寻找有效的肿瘤标志物用于癌变机理研究、疾病的早期诊断及预后判断具有重要意义。对筛选出的肝癌新蛋白标志物，通过基因敲入、敲出和裸鼠移植瘤实验等体内外实验，观察候选基因的表达被阻断或上调后对肿瘤生物学行为的影响，定位出影响人类肝癌发生发展的关键蛋白；通过生物信息学分析，解析这些关键蛋白在系统信号网络中的作用；再以MRM绝对定量验证，评估这些肝癌关键蛋白多肽诊断肝癌价值以及分析与临床相关性，提出它们在肝癌的预防、早期诊断和预后判断等临床应用方面的可行性。

主权项

一种发现和鉴定肝癌血清差异表达蛋白和验证标志物蛋白方法，其特征在于：由以下步骤组成：利用iTRAQ标记结合MALDI－TOF MS/MS技术，发现和鉴定肝癌血清差异表达蛋白，MRM验证标志物蛋白：利用iTRAQ 技术对30例肝癌和30例正常对照的血清进行分析，共检测到304个蛋白（置信度＞95％），发现了38个差异蛋白（P＜0.01），与对照相比，19个蛋白在肝癌血清中高表达，19个蛋白在肝癌血清中低表达，其中高表达2倍以上蛋白4个，低表达2倍以下蛋白6个；图1显示其中一个在肝癌中高表达的蛋白Alpha‑1‑antitrypsin；从上述iTRAQ标记发现38个差异蛋白中利用MIDAS（MRM Initiated Detection And Sequencing，MIDAS）技术，完成了14个差异蛋白MRM定性验证；利用外标法完成了三个蛋白进行MRM定量验证，在混合样品中不仅完全证明了这14个差异蛋白的存在，而且还获得了三个蛋白质肽段的定量信息；图2‑3显示的是其中两个蛋白构建的母子离子对；图4显示的是四个蛋白质的MRM 图谱。