[发明专利]一种重组质粒及其用于构建红曲色素高产菌株的方法

摘要

本发明提供了一种重组质粒及其用于构建红曲色素高产菌株的方法，该技术方案首先从植物双元质粒pCambia0380载体出发，改造并构建了一种适合丝状真菌表达的双元质粒载体pNeo0380。在此基础上，从米曲霉中克隆得到α‑淀粉酶基因，与质粒载体连接后，通过根癌农杆菌EHA105介导将其转化至野生型的红色红曲霉中，构建得到了红曲色素高产菌株，该菌株可显著促进底物大米淀粉的降解，从而提高红曲色素产量。与此同时，本发明围绕重组菌株的生物学特性设计了专用于生产淀粉酶和专用于生产红曲色素的两种发酵方法，所产淀粉酶活性及红曲色素产量均显著高于野生型菌株，同时提升了红曲色素中醇溶性成分的比例。

主权项

一种重组质粒，其特征在于是由以下方法构建的：1)取植物双元质粒pCambia0380，用限制性内切核酸酶Hind III与Bgl II酶切，而后将序列为SEQ ID No:1、SEQ ID No:2的一对寡核苷酸序列通过T4DNA连接酶与之连接，即得到双元质粒表达载体pCambia0380G；2)以质粒pUR5750为模板，以序列为SEQ ID No:3、SEQ ID No:4的一对引物进行PCR扩增，得到gpdA启动子片段，用限制性内切核酸酶BamH I与Pst I同时酶切所述gpdA启动子片段和双元质粒表达载体pCambia0380G，而后通过T4DNA连接酶将二者连接，即得到双元质粒表达载体pCambia0380G‑gpdA；3)以质粒pMD19‑TtrpC‑PtrpC‑Neo为模板，以序列为SEQ ID No:5、SEQ ID No:6的一对引物进行PCR扩增，得到终止子及Neo筛选标记片段，用限制性内切核酸酶Bgl II与Spe I同时酶切所述终止子及Neo筛选标记片段和双元质粒表达载体pCambia0380G‑gpdA，而后通过T4DNA连接酶将二者连接，即得到双元质粒表达载体pNeo0380。