[发明专利]一种获取和纯化新生小鼠少突胶质前体细胞的方法

摘要

本发明属于生物医学领域，涉及少突胶质前体细胞培养的方法，具体涉及一种从新生小鼠大脑获取和纯化少突胶质前体细胞的方法。本方法利用原代小鼠少突胶质前体细胞能够快速粘附于多聚赖氨酸包被底物的特性，通过将纯机械解离的细胞悬液短暂置于多聚赖氨酸包被的培养底面上，使少突胶质前体细胞快速贴壁、富集，并在添加无血清培养基中培养，形成大量克隆；培养6～8天后，利用小鼠少突胶质前体细胞与多聚赖氨酸包被底物粘附强度较低的特性，通过机械吹打方式进行选择性分离，获得进一步纯化的小鼠少突胶质前体细胞。获得的细胞能够维持连续增殖能力，持续保持前体状态和较高纯度，并具有分化为成熟少突胶质细胞的能力。

主权项

1.一种从新生小鼠大脑皮质获取和纯化培养少突胶质前体细胞的方法，其特征在于，利用原代小鼠少突胶质前体细胞能够快速粘附于多聚赖氨酸包被底物的特性，通过将纯机械解离的新生小鼠皮质细胞悬液短暂置于多聚赖氨酸包被的培养底面上，使小鼠少突胶质前体细胞快速贴壁、富集，并在添加PDGF的无血清培养基中培养，形成大量增殖克隆；培养6～8天后，利用小鼠少突胶质前体细胞与多聚赖氨酸包被底物粘附强度较低的特性，通过机械吹打方式，选择性分离小鼠少突胶质前体细胞，获得进一步纯化的小鼠少突胶质前体细胞；获得的细胞能够维持连续增殖能力，保持前体状态和较高纯度，具有分化为成熟少突胶质细胞的能力；包括步骤：(1)新生小鼠大脑皮质原代细胞的获取和机械解离：无菌状态分离新生小鼠大脑皮质，通过纯机械解离方法制备细胞悬液并过滤；(2)细胞悬液中细胞的快速粘附：将细胞悬液混匀后，种植在涂布多聚赖氨酸的细胞培养瓶及培养板内；静置贴壁5～30分钟(室温25℃左右)，静置过程避免震动；静置结束后，轻轻倾斜培养瓶及培养板，吸除全部液体；(3)富含小鼠少突胶质前体细胞的贴壁细胞的培养：将添加PDGF的无血清培养基沿着培养瓶壁及板壁轻轻加入；将细胞置于37℃、5％CO₂条件下静置培养；培养基每2天完全换液一次，换液前，适度手工摇晃震荡培养细胞，促使一些细胞碎片团块及死亡细胞脱壁；(4)利用机械分离方法纯化少突胶质前体细胞：细胞培养6～8天后，将细胞更换新鲜培养基，用火焰抛光管口的玻璃吸管，吸取培养液，轻柔吹打贴壁细胞，反复2～3次，逐步遍及整个培养瓶及培养板底面，促使少突胶质前体细胞脱壁；(5)少突胶质前体细胞的长期培养及诱导分化成熟：将获取的细胞继续培养，5～6天传代一次，利用上述机械吹打分离方法分离细胞，按1：2或1：3进行传代。连续传代3～5次后，在培养基中添加碱性成纤维细胞生长因子，维持少突胶质前体细胞的持续增殖，保持未分化状态；将细胞培养基中的血小板源生长因子及碱性成纤维细胞生长因子撤除，添加三碘甲状腺原氨酸(T3)，继续培养5～10天，每3天更换培养基一次，促使细胞分化成熟。