[发明专利]一种提高大麦组培快速成苗的方法

摘要

本发明提供一种提高大麦组培快速成苗的方法，步骤如下：1）选择直径大小为1‑3cm的大麦幼胚，分别用酒精和次氯酸钠表面消毒，降低杂菌污染率；2）准确分离幼胚胚芽鞘，对盾片进行二次处理，诱导愈伤组织快速发生；3）根据幼胚的大小调整预培养和农杆菌侵染的时间，预防菌液过量；4）采用弱光遮蔽法提高绿点分化率和成苗率；5）调整愈伤诱导培养基、分化培养基和生根培养基的抗生素配比和使用时间，诱导愈伤组织快速成苗。本发明为大麦幼胚的组培方法，愈伤发生快，胚性愈伤多，可操作性强，绿点分化和成苗率高，不限于材料基因型的限制；建立的大麦幼胚转化再生体系，可为探索大麦遗传改良和细胞工程育种研究提供技术支撑。

主权项

1.一种提高大麦组培快速成苗的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：/n（1）大麦幼胚材料的选择和灭菌：选择未成熟胚饱满、胚乳胶状，半透明、直径大小为1-3cm的大麦幼胚，摘除麦芒保持幼胚种皮完整，依次用酒精灭菌，再用现配的次氯酸钠溶液静置，灭菌水反复清洗，晾干；/n（2）幼胚快速准确分离与愈伤诱导：/n取步骤（1）中灭过菌的幼胚于垫有双层无菌滤纸的培养皿盖上，背部朝上，麦芒末段远离操作者；/n利用双镊子尖端夹击法，左手镊子尖端刺穿1/2胚乳处并始终固定住幼胚，右手镊子尖端撕扯下破损种皮，露出至少1/2幼胚；/n找准胚芽鞘与盾片缝隙部位，右手镊子一侧尖端勾住胚芽鞘往里往下剥离，切断在盾片底部凸起部位；/n在盾片中央用镊子尖端轻划几下造成伤口，取出完整盾片后将其正面轻抚接触诱导培养基，最后盾片正面朝上放入诱导培养基，每皿放60-80个盾片；/n如需经农杆菌侵染以获得转基因苗，则按步骤（3）操作；/n如直接用于愈伤组织诱导，则23℃黑暗培养4-5周，每两周更换一次不含潮霉素和特泯菌的诱导培养基，而后转到步骤（4）；/n（3）农杆菌侵染与筛选培养：/n按盾片直径d大小依次放入若干诱导培养基，22℃黑暗环境，d≥3 mm 时预培养为0 d、3 mm >d≥2 mm 为1 d、2 mm >d≥1 mm 为2 d、d＜1 mm 为3 d；/n使用100 μL移液枪吸取农杆菌菌液逐个滴加在盾片中央侵染愈伤，其后立即吸回多余菌液，将盾片换至新的诱导培养基；/n共培养2-3 d后，减少愈伤数目至每皿30-40个，更换两轮诱导筛选培养基，暗培养20-30 d；/n（4）愈伤的分化、成苗和炼苗：/n自愈伤起，生根前的分化阶段全程用单层A4纸遮盖培养皿盖，每张A4纸遮盖6个培养皿，营造弱光环境；/n先取步骤（2）或（3）中淡黄致密的愈伤块，每皿15个单独的愈伤块，置于转移或转移筛选培养基中培养两周；/n再在转移至分化或分化筛选培养基前，剔除颜色发白和褐化的部分，挑选有绿点分化的愈伤块转入分化或分化筛选培养基中继续培养2-4周；/n待绿点成苗后，长至2-3cm时，将其转移到含生根或生根筛选培养基的12 ml培养管中，培养2-4周后根系建成；/n炼苗时即开盖，加灭菌水至高出液面1-2cm，在外界环境适应2-3 d，洗净根周围的培养基，先在1/2大麦水培营养液中培养1周，再移至营养土中，在适宜条件下培养至收获种子；/n若为转化后的愈伤分化与成苗，步骤如上所述，培养基则为转移筛选培养基、分化筛选培养基和生根筛选培养基；/n以1L计，步骤（2）-（4）所述的各培养基组分如下，其中在农杆菌转化条件下在分化阶段逐渐减少抗生素的使用量，除植物凝胶高压灭菌，其余成分均过滤灭菌：/na.诱导培养基：4.3 g MS基础培养基 + 30 g麦芽糖 + 1.0 g干酪素水解物 + 350 mg肌醇 + 690 mg脯氨酸 + 1.0 mg盐酸硫胺 +1.25 mg CuSO₄·5H₂O + 2.5 mg麦草畏 + 3.5g植物凝胶，1 M NaOH调至pH=5.8；/n诱导筛选培养基：a中诱导培养基 + 50 mg潮霉素 + 160 mg特泯菌；/nb.转移培养基：2.7 g不含硝酸铵的MS培养基+ 20 g麦芽糖 + 165 mg 硝酸铵+ 750mg谷氨酰胺 + 100 mg肌醇 + 0.4 mg盐酸硫胺 + 1.25 mg CuSO₄·5H₂O + 2.5 mg 2,4-D+ 0.1 mg 6-BA+ 3.5 g植物凝胶，1 M NaOH调至pH=5.8；/n转移筛选培养基：b中转移培养基 + 40 mg潮霉素 + 120 mg特泯菌；/nc.分化培养基：MS微量元素+ N6大量元素+ N6 铁盐+ B5有机成分+ 30 g麦芽糖 +100 mg肌醇 + 690 mg脯氨酸 + 0.1 mg 2,4-D + 1.0 mg 6-BA +3.5 g植物凝胶，1 MNaOH调至pH=5.8；/n其中MS微量元素的组成是22.3 mg MnSO₄·H₂O + 8.6 mg ZnSO₄·7H₂O + 6.2 mgH₃BO₃ + 0.25 mg Na₂MoO₄·H₂O +0.025 mg CuSO₄·5H₂O + 0.025 mg CoCl₂·6H₂O +0.83mg KI，N6大量元素的组成是2.8 g KNO₃+ 0.46 g (NH₄)₂SO₄ + 0.4 g KH₂PO₄ + 185 mgMgSO₄·7H₂O + 165 mg CaCl₂·2H₂O，N6 铁盐的组成是37.3 mg Na₂·EDTA·2H₂O + 27.8mg FeSO₄·7H₂O，B5有机成分的组成是1.0 mg 维生素B1 + 0.5mg 维生素B6 + 2 mg 甘氨酸 + 0.5 mg 烟酸；/n分化筛选培养基：c中分化培养基 + 30 mg潮霉素 + 80 mg特泯菌；/nd.生根培养基：4.3 g MS基础培养基 + 25 g麦芽糖 + 1.0 g干酪素水解物 + 350 mg肌醇 + 690 mg脯氨酸 + 1.0 mg盐酸硫胺 + 3.2 g植物凝胶，1 M NaOH调至pH=5.8；/n生根筛选培养基：d中生根培养基 + 20 mg潮霉素 + 40 mg特泯菌。/n