[发明专利]一种重组腈水合酶的高效表达方法

摘要

本发明公开了一种重组腈水合酶的高效表达方法，该方法包括：(1)从原始菌株中克隆得到目的基因；(2)构建重组载体，将重组载体转化至宿主细胞，得到基因工程菌；(3)培养所述基因工程菌，获得重组腈水合酶蛋白；所述目的基因由编码α亚基和β亚基的腈水合酶基因和活化元件基因依次连接而成；其中，所述腈水合酶基因的碱基序列如SEQ ID NO.1或4所示，所述活化元件基因的碱基序列如SEQ ID NO.2或5所示。本发明方法通过在腈水合酶结构基因的基础上加入活化元件基因，并采用自诱导培养基培养工程菌，获得了高活力的重组腈水合酶。

主权项

1.一种重组腈水合酶的高效表达方法，包括：（1）从原始菌株中克隆得到目的基因；（2）构建重组载体，将重组载体转化至宿主细胞，得到基因工程菌；所述重组载体为pET‑21a(+)、pET‑24a(+)、pET‑28a(+)、pET‑30a(+)或pET‑Duet；所述宿主细胞为大肠杆菌E. coliBL21(DE3)；（3）培养所述基因工程菌，获得重组腈水合酶蛋白；其特征在于，所述目的基因由编码α亚基和β亚基的腈水合酶基因和活化元件基因依次连接而成；其中，所述腈水合酶基因的碱基序列如SEQ ID NO.4所示，所述活化元件基因的碱基序列如SEQ ID NO.5所示；步骤（3）中，所述培养的过程包括：将所述工程菌活化后，进行扩大培养，再采用自诱导培养基进行发酵培养；所述自诱导培养基为：0.36 g/L葡萄糖，6.84 g/L甘油，2.04 g/L乳糖，12 g/L酵母抽提物，17.1 g/L Na2HPO4·12H2O，3.0 g/L KH2PO4，0.5 g/L NaCl，1.0 g/L NH4Cl和0.6 g/L MgSO4；所述发酵培养的温度为18～20℃，pH7.0～7.5；所述活化培养的固体培养基为：蛋白胨10 g/L，酵母抽提物5 g/L，氯化钠10 g/L，pH7.0，琼脂粉20g/L，卡那霉素的浓度为50 µg/mL；所述扩大培养的培养基为：蛋白胨10 g/L，酵母抽提物5 g/L，氯化钠10 g/L，pH7.0，卡那霉素的浓度为50 µg/mL。