[发明专利]一种麦穗鱼肝脏线粒体膜流动性的活体测试方法

摘要

本发明涉及鱼肝脏线粒体膜流动性的测试，具体涉及一种麦穗鱼肝脏线粒体膜流动性的活体测试方法，该方法包括S1.鱼体暴露实验；S2.麦穗鱼活体肝脏线粒体膜的制备；S3.DPH溶液的制备；S4.线粒体膜DPH荧光探针的标记；S5.膜流动性测定；S6.线粒体的蛋白质含量测定。本发明麦穗鱼肝脏线粒体膜流动性的活体测试方法，方便准确的测定药剂对鱼线粒体膜流动性的影响。

主权项

1.一种麦穗鱼肝脏线粒体膜流动性的活体测试方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.鱼体暴露实验麦穗鱼体暴露实验采用水体染毒法：将麦穗鱼室内驯化10‑16天，随机暴露于药液处理组的玻璃缸内，进行染毒暴露；S2.麦穗鱼活体肝脏线粒体膜的制备取暴露时间终点的麦穗鱼，解剖取其肝脏，在生理盐水中清洗去除结缔组织和脂肪组织，剪碎，加入冷蔗糖提取液，匀浆，过滤，匀浆液离心，取上清液，离心，弃上清液，用冷蔗糖提取液悬浮沉淀，再次离心，最后制得的线粒体沉淀用冷蔗糖提取液悬浮，即获得肝脏线粒体悬浮液；S3.DPH溶液的制备DPH溶液为DPH浓度为2×10‑6M的四氢呋喃溶液；S4.线粒体膜DPH荧光探针的标记在所述肝脏线粒体悬浮液中加入PBS缓冲液，加入DPH荧光探剂，在25℃下温育30‑40min即可；S5.膜流动性测定膜流动性的测定是通过荧光分光光度仪测定标记的线粒体膜的荧光偏振度P的变化；用恒温水浴控制测试体系的温度；按照以下公式计算荧光强度F和荧光偏振度P：F＝IⅡ+2II P＝IⅡ‑GII/IⅡ+GII G：校正因子 G＝IHV/IHHIHV式中IⅡ为起偏器和检偏器光轴均在垂直方向时的荧光强度；II起偏器光轴和检偏器光轴分别在垂直方向和水平方向时的荧光强度；IHV为起偏器和检偏器分别在水平和垂直方向时的荧光强度；IHH为起偏器和检偏器均在水平方向时的荧光强度；膜流动性以1/P来表示，若膜的荧光偏振度P增大，则膜的流动性降低，反之，则膜的流动性增加；其中，在步骤S4中，所述肝脏线粒体悬浮液中加入PBS缓冲液后，肝脏线粒体悬浮液中蛋白含量为125‑160μg/ml；在步骤S5中，所述荧光分光光度仪的激发光源波长设定为362nm，狭缝为10nm；发射波长设定为428nm，狭缝为10nm。