[发明专利]一种马尾松胚性愈伤组织的冷冻保存方法

摘要

本发明公开了一种马尾松胚性愈伤组织的冷冻保存方法，包括组织采集、分散处理、添加抗冻剂和分装与冷冻工序，采集外围粘性大、透明性好的马尾松胚性愈伤组织作为保存材料，将其放入装有基础液的无菌锥形瓶中进行分散处理，再添加抗冻剂，将组织液分装于冻存管中分步降温冷冻，最后置于‑196℃液氮中进行冷冻保存。通过本发明技术，冷冻保存后的马尾松胚性愈伤组织在解冻4‑5周后即能恢复正常生长，且胚性愈伤增殖快、活力旺盛，体胚培养周期明显缩短，效果显著，实现了马尾松胚性愈伤组织的超低温冷冻保存，有效促进了马尾松体胚育苗产业化技术体系的形成，对推进马尾松优良种质资源的保存利用及生物工程、细胞工程的育苗进程意义重大，具有显著的经济效益和社会效益。

主权项

一种马尾松胚性愈伤组织的冷冻保存方法，其特征在于：包括组织采集、分散处理、添加抗冻剂和分装与冷冻工序，采集外围粘性大、透明性好的马尾松胚性愈伤组织作为保存材料，将其放入装有基础液的无菌锥形瓶中进行分散处理，再添加抗冻剂，将组织液分装于冻存管中分步降温冷冻，最后置于‑196℃液氮中进行冷冻保存；主要操作步骤如下：（1）组织采集：对经过体胚诱导获得的马尾松胚性细胞在常规条件下进行增殖培养7‑10 d，采集外围粘性大、透明性好的胚性愈伤组织作为保存材料；（2）分散处理：选取1‑2 g采集的胚性愈伤组织放入25‑50 mL无菌锥形瓶中，并加入3‑7 mL基础液后密封；在适宜的环境中，将密封后的无菌锥形瓶置于旋转振荡器上进行振荡分散；（3）添加抗冻剂：将分散处理后的无菌锥形瓶置于冰上，在无菌条件下往瓶中加入0.5 mL体积浓度17%DMSO，充分摇匀，每5 min加一次，每次加样摇匀一次，直至瓶中DMSO的最终体积浓度为5‑8%，停止加样；（4）分装与冷冻：将步骤（3）得到的无菌锥形瓶密封保存于4℃冰箱内，静置30‑60 min后，取无菌锥形瓶中的组织液分装于冻存管中，然后将冻存管置于‑70℃条件下冷预处理2‑3 h，最后直接将冻存管投入‑196℃液氮中进行冷冻保存。