[发明专利]一种基于适配体DNAzyme对铅离子检测的方法

摘要

一种基于适配体DNAzyme对Pb2+检测的方法，属于生物检测领域。本发明包括生物素修饰的Pb2+的DNAzyme的底物链包被酶标板，Pb2+的DNAzyme链与底物链杂交形成双链结构，Pb2+的检测以及紫外吸收值的测定。本发明借助于Pb2+依赖的DNAzyme的催化作用和G四联体‑hemin复合物的酶催化作用，使得在不同浓度Pb2+存在的条件下，G四联体‑hemin复合物催化底物显色产生差异，根据Pb2+浓度和紫外吸收值的对应关系，从而实现对Pb2+的检测。本发明方法灵敏度高、检测限低、特异性好，同时检测速度快、成本低廉，是一种理想的Pb2+检测方法。

主权项

一种基于适配体DNAzyme对Pb2+检测的方法，其特征在于包括如下步骤：（1）生物素修饰的Pb2+的DNAzyme的底物链包被酶标板首先将链霉亲和素用碳酸盐缓冲液溶解，再将其用碳酸盐缓冲液稀释成0.5~2.0ng/mL的包被浓度，以100μL/孔的包被量包被到96孔酶标板上，置于37℃烘箱中孵育2h，孵育完后将酶标板用含有0.5%Tween20的pH7.4的0.01M PBS洗涤液洗涤3次，最后拍干；生物素修饰的Pb2+的DNAzyme的底物链用pH7.4的0.01M PBS溶解，DNAzyme底物链的一端连接有G四联体DNA，再将其稀释成2.0~8.0ng/mL的浓度，加入到链霉亲和素包被好的酶标板中，每孔加100μL，将其置于37℃烘箱中孵育1h后，从烘箱中取出，用洗液洗涤3次拍干，即制得Pb2+的DNAzyme的底物链包被的酶标板；底物链DNA：5’‑ACTCACTAT(rA)GGAAGAGATGTGGGTAGGGCGGGTTGGGAAA‑3’；（2）Pb2+的DNAzyme链与底物链杂交形成双链结构Pb2+的DNAzyme用pH8.0的TE缓冲液溶解，将其稀释成2.0~8.0ng/mL的浓度，加入到步骤（1）包被好的酶标板中，每个孔的添加量为100μL，在37℃条件下反应2h后，用洗液洗涤3次拍干，以除去未杂交的DNAzyme分子，从而得到含有DNAzyme杂交双链结构的酶标板；Pb2+的DNAzyme ：5’‑CATCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTGAGT‑3’；（3）Pb2+的检测以及紫外吸收值的测定将Pb2+用切割缓冲液稀释成不同的浓度，具体浓度为：0ng/mL、0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL，再将稀释好的Pb2+加入到步骤（2）制备的酶标板中，每孔加入100μL，在50℃的条件下进行酶切反应5~20min；酶切反应完后，将酶标板用洗液洗涤3次，每孔加入浓度为0.5μM的hemin100μL，25℃条件下反应1h后，每孔加入TMB显色液50μL，在37℃显色15‑30min后，再加入50μL终止液，最后用酶标仪测定480nm的紫外吸收值。