[发明专利]从小鼠致密骨中高效获取间充质干细胞的方法

摘要

本发明涉及间充质干细胞获取方法，旨在提供一种从小鼠致密骨中高效获取间充质干细胞的方法。提供一种高效获取小鼠间充质干细胞的方法，包括小鼠间充质干细胞的分离、原代培养、小鼠间充质干细胞的扩增培养等步骤。本发明极大程度缩短了细胞培养所用时间，获取的细胞量极大提升，更少的非MSCs贴壁细胞的污染的优势。本发明首次建立多次骨片贴片培养法，使细胞得率提高3‑5倍。本发明通过对小鼠致密骨MSCs生物学特性如生长状态、表面标志物、多向分化潜能等方面的系统研究，证实了经体外10次扩增培养以后，细胞仍具有较强的干细胞特性，可满足实验研究的需要。不但能快速高效获取干细胞，而且获得的干细胞具有较快的增殖生长速度，及较强的分化潜能。

主权项

一种高效获取小鼠间充质干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)小鼠间充质干细胞的分离：将小鼠肱骨、胫骨和股骨冲洗骨髓腔后，剪碎成骨片；将骨片转移到含有2mg/ml II型胶原酶和含10％(v/v)胎牛血清的MEM培养液中，37℃下振荡消化；吸弃上层消化液，用含10％(v/v)胎牛血清的MEM培养液反复清洗骨片，将其接种到盛有完全培养液的塑料平皿中，在37℃、5％二氧化碳培养箱中静置培养3天；在第三个培养日更换新鲜的完全培养液，在37℃、5％二氧化碳培养箱中继续培养2天，骨片周围爬出来的细胞集落即为原代MSCs细胞；(2)原代培养：继续上一步骤的培养，第5个培养日吸弃细胞培养液；滴加磷酸盐缓冲液浸洗贴壁细胞多次，吸弃洗涤液，加胰蛋白酶，室温消化至80％以上贴壁细胞脱落；加入含10％(v/v)胎牛血清的MEM培养液终止消化，经离心分离所得的细胞沉淀用完全培养液重悬，接种到细胞培养瓶中，在37℃、5％二氧化碳培养箱中静置培养；每48小时更换培养液，每天观察细胞的生长状态；培养至3‑4天后，将骨片再次接种到含完全培养液的塑料平皿中，在37℃、5％二氧化碳培养箱中静置培养；骨片周围再次爬出来的细胞集落重复本步骤的操作；重复接种骨片的操作共3‑5次；(3)小鼠间充质干细胞的扩增培养：当原代培养的细胞密度达到90％以上时，吸弃细胞培养液，磷酸盐缓冲液浸洗贴壁细胞多次，吸弃洗涤液，加胰蛋白酶室温消化至80％以上贴壁细胞脱落，加入完全培养液终止消化；经离心分离所得的细胞沉淀用完全培养液重悬，并进行分瓶传代扩增培养；所述完全培养液是含有终浓度2mmol/L L‑谷氨酰胺、100μg/ml青霉素、100μg/ml链霉素、3.7g/L碳酸氢钠和10％(v/v)胎牛血清的MEM培养液。