[发明专利]一种检测蚯蚓体腔细胞DNA损伤的方法及其运用

摘要

本发明提供一种检测蚯蚓体腔细胞DNA损伤的彗星实验方法，该方法包括简易再胶片的制作以及蚯蚓体腔细胞的制备，只是需要铺一层胶就可以进行彗星实验，简单，准确率高，而且效率高。

主权项

1.一种检测蚯蚓体腔细胞DNA损伤的彗星实验方法，其中，该方法包括：(1)提供一种蚯蚓彗星实验载胶片的制备方法，该方法包括：提供长宽为25.4mm×75.6mm，厚度为1mm‑1.2mm的普通载玻片和长为3‑4mm，宽为1‑2mm的玻璃条及胶水；在每个载玻片上，沿长轴方向粘牢4个玻璃条，玻璃条间隔相等且分布在载玻片正中间，玻璃条之间的空间即为胶槽，从而得到用于彗星实验的载胶片；其中，所述的4个玻璃条是从所述载玻片的沿短边切割下来的；(2)一种蚯蚓体腔细胞的制备方法，该方法包括：①每处理取蚯蚓2条，用超纯水清洗体表至无脱落物，用吸水纸除去蚯蚓体表水膜；②每个2ml离心管放入1只蚯蚓，再加1ml体腔细胞提取液，室温静置5min弃死蚓，得到蚯蚓体腔细胞的粗提液，其中，所述的蚯蚓体腔细胞提取液每100ml的配方为NaCl 0.413g，Na₂‑EDTA·2H₂O 0.204g，愈创木酚甘油醚0.998g，用超纯水80ml，调节pH7.5，定容至100ml；③对粗提液进行三次离心纯化蚯蚓体腔细胞，前两次离心条件为：转速均为2000RPM，时间为达到所需转速时间；第三次离心条件为：4℃3000r/min离心6min；④弃上清液，得到沉淀的细胞，每管加入PBS并均匀悬浮分散体腔细胞，置于37℃保温；(3)蚯蚓彗星实验凝胶的制备方法，该方法包括：天平称取所需低熔点琼脂糖若干，加入PBS溶液，其中，琼脂糖与PBS溶液的质量体积比为1:150，在微波炉上加热熔化胶，冷却胶液并保持在60℃,混胶前冷却至37℃；(4)提供一种蚯蚓彗星实验铺胶方法：取37℃的细胞悬液与37℃胶按体积比1∶3的比例混匀后，立即铺在步骤(1)制备好的载胶片的胶槽中；胶铺好后室温下冷却15min；(5)提供一种蚯蚓彗星实验细胞裂解方法：①冷却结束后，将胶片浸入裂解液工作液中，置于4℃暗室2h；②2h后取出胶板，用4℃蒸馏水浸泡两次。