[发明专利]一种阿维拉霉素高产菌株的筛选方法

摘要

本发明涉及微生物菌株筛选技术领域，具体涉及一种阿维拉霉素高产菌株的筛选方法。本发明通过制备绿色产色链霉菌原生质体，采用ARTR系统对原生质体进行诱变，结合诱变菌株的形态特征和菌落抑菌生物效价进行初筛，然后通过摇瓶复筛，以阿维拉霉素抑菌效价及阿维拉霉素A组分含量为指标进行筛选，筛选得到的菌株具有发酵稳定性高，阿维拉霉素产量高，而且有效组分含量高的优点。本发明降低了制备相关产品的成本，显示了非常好的工业化应用潜力。

主权项

一种阿维拉霉素高产菌株的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.取活化培养好的绿色产色链霉菌斜面一支，作为出发菌株，加入4～6mL无菌生理盐水洗脱，制备孢子悬液，并按4％～6％的接种量转入含5％甘氨酸的装有50mL种子培养基的250mL带挡板三角摇瓶，27～29℃，210～230rpm继续培养24h，培养结束后，将菌液5000～7000rpm，4℃离心5～10min，磷酸高渗缓冲液清洗两次，弃去上清，得到原生质体制备的出发菌丝体；S2.以SMM溶液作为渗透压稳定剂，在步骤S1制备的出发菌丝体管中加入终浓度为9mg mL‑1～15mg mL‑1溶壁酶5mL，30℃条件下分别酶解45min～75min，温育结束后，采用无菌脱脂棉过滤除去未酶解的菌丝，收集滤液，4℃，2000rpm离心10min，弃上清，然后再用SMM溶液洗涤离心两次，最后用3mL的SMM溶液重悬细胞，得到原生质体悬液；S3.将步骤S2原生质体悬液置于无菌的试管中，进行ARTP诱变：预设以氦气作为工作载气，设定功率为115W，通气量为10L min‑1，等离子发射源与样品之间的距离为1～3mm，处理30～50s；S4.将步骤S3 ARTP诱变处理后的原生质体涂布于再生平板并置于28℃恒温培养箱培养3天，选择菌落大小、形状、外观形态发生变化的单菌落转接至另外的固体平板，27～29℃继续恒温培养2天，培养结束后采用灭过菌的的打孔器将单个菌落打下，并置于无菌湿润的无菌小盘中继续培养3天，至菌丝长满培养基表面；然后取菌落小块置于含有1％的检菌的琼脂平板上，37℃培养24h后观察并测定琼脂块抑菌圈大小，挑选抑菌圈比出发菌株大的菌株；S5.将步骤S4筛选获得的菌落从斜面接种至种子摇瓶，然后再转接发酵摇瓶，27～29℃，210～230rpm，振荡培养72h，收集发酵液；取10mL发酵液至10mL离心管中，6000×g离心10min，弃上清，甲醇重悬后转移至100mL容量瓶中，40Khz频率超声40min，冷却，甲醇定容，0.45μm过滤膜过滤，进行生物抑菌效价检测，同时采用HPLC法检测阿维拉霉素A的含量，挑选出抑菌效价高，阿维拉霉素A的产量高的菌株。