[发明专利]基于MALDI-MS及稳定同位素标记N聚糖快速定量分析方法及应用

摘要

本发明公开了一种基于MALDI‑MS及稳定同位素标记的N聚糖快速定量分析方法及应用，属于糖蛋白组学分析领域，本方法为：(1)在微波辅助下PNGase F使N聚糖以糖胺的形式释放，(2)d0/d5‑苯甲酰氯分别与糖胺发生亲核反应，之后纯化，(3)将d0‑苯甲酰氯和d5‑苯甲酰氯衍生的聚糖以摩尔比1:1的比例进行混合，(4)对混合后的d0/d5‑苯甲酰氯衍生的N聚糖进行甲胺化反应，(5)MALDI‑MS检测，(6)数据分析；本发明实现对中性糖和酸性糖的同时定量分析、降低实验成本、提升实验效率、缩短反应时间、有比较广的线性定量范围、可用于血清聚糖分析，具有医学应用价值。

主权项

一种基于MALDI‑MS及稳定同位素标记的N聚糖快速定量分析方法，其特征在于：该方法应用MALDI‑MS及稳定同位素标记技术，对N聚糖快速定量分析，具体包括如下步骤：(1)标准糖蛋白或血清溶解于反应溶液中，之后于100℃水浴中煮沸10min，加入10％的NP‑40，混匀后再加入PNGase F，在微波辅助条件下酶切20min，使N聚糖以糖胺形式释放；所述反应溶液含有10mM磷酸钠、0.13％的十二烷基硫酸钠、10mM二硫苏糖醇；(2)将步骤(1)所得糖胺与d0/d5‑苯甲酰氯溶液混匀，常温放置30min；(3)对步骤(2)的反应溶液进行SPE纯化处理,其步骤为：①去离子水清洗MCC纯化柱；②平衡液对MCC进行平衡；③将平衡液加入步骤(2)的聚糖反应体系中，充分混匀，上样；④平衡液对MCC进行冲洗，脱去所有杂质；⑤洗脱液对样品进行洗脱，蒸干备用；(4)将d0‑苯甲酰氯和d5‑苯甲酰氯衍生的N聚糖以摩尔比1:1进行混合，将甲胺盐酸盐溶液和PyAOP溶液加入到上述混合样品中，于常温、黑暗处静置30min，SPE纯化，步骤同上；(5)将步骤(4)双衍生化的N‑聚糖溶于50％的乙腈溶液中，取该样品溶液与DHB溶液混合后点到样孔板上，样孔板水平静置15min使溶剂挥发，然后通过MALDI‑MS 5800完成N‑聚糖检测；所述50％的乙腈溶液为乙腈:水＝1:1；基质辅助激光解吸电离质谱仪相关参数设置如下：检测模式，Reflector Positive；激光强度5200；电压倍数0.60；离子的质量范围1000‑5000m/z；(6)MALDI‑MS数据由软件Data Explorer 4.0解析；N‑聚糖的结构示意图由软件GlycoWorkbench 2.1指定。