[发明专利]一种水稻悬浮细胞系快速培养的方法

摘要

本发明涉及一种水稻悬浮细胞系快速培养的方法，属生物技术领域。该水稻悬浮细胞系快速培养的方法包括：外植体的选择、外植体的灭菌、愈伤组织的诱导、愈伤组织的继代、悬浮细胞的培养步骤。本发明对培养悬浮细胞培养基和继代时处理悬浮细胞的方法进行了改进。即继代时处理悬浮细胞时，在继代第3次液体培养基后用孔径大小依次约为10目，20目，40目已灭菌的筛网对悬浮培养的细胞进行筛选，滤去大颗粒细胞团，只留下大小均一的细胞团，用此法1.5‑2个月就能够建立起良好的胚性悬浮细胞系。该方法成本低、操作简单、缩短试验周期，降低了悬浮细胞系污染的风险，是一种高效、快速的新方法，也为利用水稻悬浮细胞系作为实验材料的相关研究提供了一个平台。

主权项

1.一种水稻悬浮细胞系快速培养的方法，其特征在于水稻为栽培稻02428或疣粒野生稻的培养方法的具体步骤如下：a.外植体的选择：选择成熟胚或幼胚，装于透气网袋中，置于4℃冰箱中保存备用；b.外植体灭菌：取出保存于4℃冰箱中的成熟胚或幼胚，剥去其颖壳，放入已灭菌的100mL三角瓶中用体积百分比为75％的酒精浸泡1分钟进行表面消毒，摇动三角瓶，无菌蒸馏水冲洗5‑6次，再用体积百分比为15％的次氯酸钠溶液消毒，每50mL次氯酸钠溶液加1滴Tween20，在摇床中室温110r/min黑暗下振荡15分钟或18分钟消毒，无菌蒸馏水冲洗10次或12次，最后用不添加Tween20的体积百分比为15％的次氯酸钠溶液在摇床中室温110r/min黑暗下振荡15分钟消毒，消毒后用无菌蒸馏水冲洗10次或12次，直到清洗后的水中没有次氯酸钠溶液残留；c.愈伤组织的诱导：消毒后将胚放在无菌滤纸上于超净台上风干表面多余的水分，用灭菌的镊子将胚接种于N6诱导培养基中，每皿8颗或12颗种子，置于培养箱中28℃、2000Lux光照培养，光照时间为每天6:00‑22:00时，经10天或25天长出愈伤组织，N6诱导培养基配方为：N6+2.8mg/L 2,4‑D+300mg/L水解络蛋白+1.0g/L L‑脯氨酸+30g/L蔗糖+0.5g/L MES+3.0g/L植物凝胶，pH5.6‑5.8；d.愈伤组织继代：将诱导出的愈伤组织用灭菌的手术刀切割成3mm或4mm后接种于N6继代培养基，每皿12枚愈伤块；将接种愈伤的培养皿放到培养箱中在28℃、空气相对湿度60％、以2000Lux光照培养，光照时间为每天6:00‑22:00时，每12天继代一次，N6继代培养基配方为：N6+2.5mg/L 2,4‑D+300mg/L水解络蛋白+1.0g/L L‑脯氨酸+30g/L蔗糖+0.5g/L MES+3.0g/L植物凝胶，pH5.6‑5.8；e.悬浮细胞的培养：选取组培常规方法继代2次以上的0.48g或0.52g质地坚硬、结构致密、颗粒松散、颜色鲜黄的愈伤加入到含有30mL N6液体培养基的100mL三角瓶中，置于往复式摇床上28℃、110r/min黑暗条件培养，每5天继代1次，每次继续代时倾去占总体积2/3的上清液，补充新鲜的N6液体培养基至30mL继续培养，上述条件继代2次，从继代第3次开始，每次继代倾去占总体积2/3的上清液并补充新鲜的N6液体培养基至30mL后用10目已灭菌的筛网过滤悬浮细胞，只保留能通过10目筛网的悬浮细胞继续培养；从继代第6次或第7次开始，每次继代倾去占总体积2/3的上清液并补充新鲜的N6液体培养基至30mL后用已灭菌的20目不锈钢筛网过滤悬浮细胞，只保留能通过20目筛网的悬浮细胞继续培养；从继代第8次或第9次开始，每次继代时倾去占总体积2/3的上清液并补充新鲜的N6液体培养基至30mL后用40目已灭菌的筛网过滤悬浮细胞，只保留能通过40目筛网的悬浮细胞继续培养；到继代第10次或第11次即第50天或55天时，倾去占总体积2/3的上清液并补充新鲜的N6液体培养基至30mL后用40目已灭菌的筛网过滤悬浮细胞，只保留能通过40目筛网的悬浮细胞即获得生长状态均一，分散性好，如沙尘状的细胞团即悬浮细胞系。