[发明专利]一种用于检测PD-L1的快速检测试剂盒及其检测方法

摘要

本发明属于医学检验技术领域，具体涉及一种用于检测PD‑L1的快速检测试剂盒及其检测方法。本发明提供的用于检测PD‑L1的快速检测试剂盒包括发光底物溶液Ⅰ，发光底物溶液Ⅱ，浓缩洗涤液，PD‑L1标准品，PD‑L1质控品，抗体吖啶酯标记物和磁珠免疫复合物。本发明提供的用于检测PD‑L1的快速检测试剂盒具有检测时间短、用量少、高效、灵敏度高、特异性强、稳定的重复性和可靠性等优点。

主权项

一种用于检测PD‑L1的快速检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括发光底物溶液Ⅰ，发光底物溶液Ⅱ，浓缩洗涤液，PD‑L1标准品，PD‑L1质控品，抗体吖啶酯标记物和磁珠免疫复合物；所述抗体吖啶酯标记物的制备包括以下步骤：1.1 取PD‑L1单克隆抗体，用浓度为0.05mol/L，pH为9.5的碳酸盐缓冲溶液调整PD‑L1单克隆抗体的浓度为1mg/mL，得溶液A；1.2 取吖啶酯，加入二甲基甲酰胺使吖啶酯的浓度至2mg/mL，得溶液B；1.3 将步骤1.2所得溶液B加入到步骤1.1所得溶液A中，吖啶酯与PD‑L1单克隆抗体的摩尔比为14～22∶1，室温反应，反应时间为25～50min，得反应液；1.4 将步骤1.3所得反应液移至截留分子量为7500～95000的透析袋内，用浓度为0.05mol/L，pH为9.5的碳酸盐缓冲溶液透析24h，加入与上述反应液等体积的甘油，置‑25℃保存，即得；所述磁珠免疫复合物的制备包括以下步骤：取100μL浓度为10mg/mL的链霉亲和素磁珠，用250μL浓缩洗涤液按照1∶100稀释得到的溶液洗涤4次，加入50μL生物素化PD‑L1单克隆抗体，置于37℃恒温气浴摇床中振荡，振荡速度为100r/min，12～16min后取出，用200μL浓缩洗涤液按照1∶100稀释得到的溶液洗涤4次，然后，重新置于上述恒温气浴摇床中，加入1mL含体积分数为2％BSA的pH为7.4，浓度为1M的磷酸盐缓冲液进行封闭反应，封闭反应时间为15～22min，取出，磁性分离，去上清，用200μL浓缩洗涤液按照1∶100稀释得到的溶液洗涤4次，加入pH为7.4，浓度为1M的磷酸盐缓冲液配成1mg/mL的磁珠免疫复合物，置于4℃避光保存，即得；其中，浓缩洗涤液的制备方法为：向pH为7.4，浓度为1M的磷酸盐缓冲液中加入Tween‑20，使Tween‑20的体积分数为5％；所述链霉亲和素磁珠的制备包括以下步骤：2.1配制pH为7.0，浓度为0.1M的磷酸盐缓冲液，灭菌，灭菌温度为120℃，灭菌时间为18min，将1mg的链霉亲和素溶于1mL上述磷酸盐缓冲液中，得链霉亲和素溶液，取400μL链霉亲和素溶液装于EP管中；2.2取5mL修饰的壳聚糖磁性微球，加入4.5mL戊二醛，室温震荡反应，反应时间为4h，进行磁分离，用水清洗除去多余的戊二醛后，将磁性微球重新悬浮在5mLpH为7.0，浓度为0.1M的磷酸盐缓冲液中，得磁性微球液；2.3 将步骤2.2所得磁性微球液加入到步骤2.1装有400μL链霉亲和素溶液的EP管中，室温震荡培养4h，磁分离，得固体物，将所得固体物分散在10mLpH为7.0，浓度为0.1M的磷酸盐缓冲液中，使固体物的浓度为10mg/mL，得链霉亲和素磁珠；步骤2.2所述的修饰的壳聚糖磁性微球的制备包括以下步骤：3.1称取4.02g无水乙酸钠，加入2.9mL冰醋酸，搅拌至完全溶解，加入去离子水稀释至500mL，得浓度为0.1M的乙酸钠缓冲液；3.2称取2.5g壳聚糖，加入1.5mL冰醋酸，搅拌至完全溶解，加入250mL去离子水以及250mL步骤3.1所得浓度为0.1M的乙酸钠缓冲液，摇匀，得壳聚糖乙酸缓冲液；3.3称取4.7g硫酸亚铁铵和9.67g硫酸铁铵，研磨混匀，加入250mL步骤3.1所得浓度为0.1M的乙酸钠缓冲液以及100mL步骤3.2所得壳聚糖乙酸缓冲液，混合均匀，得混合液；3.4在氮气保护的密闭体系环境下，向三颈瓶中加入100mL浓度为6M的氢氧化钠溶液，搅拌，加热升温至60℃，平均分三次加入步骤3.3所得混合液，每次加入的时间间隔为30分钟，加完后维持反应45min，用去离子水反复洗涤所得产物，直至上层液体变澄清，用试剂AgNO3检查硫酸根离子至无沉淀为止，磁分离，得固体产物，将所得固体产物冷冻干燥得壳聚糖磁性纳米粒子；3.5取0.5g步骤3.4所得壳聚糖磁性纳米粒子，加入10mL质量浓度为0.1％的聚乙烯醇溶液，超声分散，得内水相，称取0.6g甲氧基聚乙二醇‑聚乳酸溶于15mL二氯甲烷中，得油相，将上述内水相和油相混合，超声乳化，超声乳化时间为16min，得复乳；3.6将步骤3.5所得复乳加入到20mL质量浓度为0.1％的聚乙烯醇溶液中，均质乳化，均质乳化速度为6000r/min，均质乳化时间为18min，将二氯甲烷挥发完全，得产物，将所得产物用去离子水反复洗涤，磁分离，得固体产物，向所得固体物中加入pH为7.0，浓度为0.1M的磷酸盐缓冲液，使固体产物的浓度为20mg/mL，得修饰的壳聚糖磁性微球；所述生物素化PD‑L1单克隆抗体的制备包括以下步骤：4.1取PD‑L1单克隆抗体，用浓度为0.05mol/L，pH为9.5的碳酸盐缓冲溶液调整PD‑L1单克隆抗体的浓度为1mg/mL，得溶液A；4.2将生物素、二环己基碳二亚胺和N‑羟基琥珀酰亚胺溶于二甲基甲酰胺中，生物素、二环己基碳二亚胺和N‑羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1∶1∶1.2，于50℃水浴中磁力搅拌反应，反应时间为12h，滤去反应液中生成的白色沉淀二环己基脲，收集滤液，加入乙醚至沉淀不再增加，置于冰浴中，放置时间为1h，过滤收集沉淀，得活性生物素酯粗品，将上述活性生物素酯粗品用热异丙醇溶解，置于冰浴中，放置时间为3h，过滤收集结晶，用二甲基甲酰胺溶解后加入乙醚，置于冰浴中，放置时间为1h，过滤收集沉淀，真空干燥，得活性生物素酯；4.3向步骤4.1所得溶液A中加入步骤4.2所得活性生物素酯，活性生物素酯与PD‑L1单克隆抗体的摩尔比为11～14∶1，室温反应，反应时间为35～50min，得反应液；4.4 将步骤4.3所得反应液移至截留分子量为7500～95000的透析袋内，用浓度为0.05mol/L，pH为9.5的碳酸盐缓冲溶液透析24h，加入与上述反应液等体积的甘油，置‑25℃保存，即得。