[发明专利]一种落叶松植物离体发生的方法

摘要

本发明提供了一种落叶松植物高效离体发生的方法，具体地，本发明首次发现对落叶松植物实生苗的下胚轴为起始外植体，进行离体繁殖，可诱导出含有许多胚性细胞的愈伤组织，并可进一步高效诱导不定芽的发生,并经过不定芽的伸长、生根及移栽成苗后，可获得大量再生植株表型一致性高、遗传稳定性好的落叶松植物，此外，还可以作为体细胞杂交的亲本之一，进行细胞杂交，可创造不同于原亲本的落叶松新种质。

主权项

1.一种落叶松植物的繁殖方法，其特征在于，包括步骤：(a)对所述落叶松植物的种子进行萌发处理，从而获得经萌发的种苗；(b)对所述经萌发的种苗培养n天，其中n为4‑20，从而获得经培养的实生苗；(c)对所述实生苗的下胚轴进行切取，获得下胚轴切段，所述下胚轴切段的长度为1‑6mm；和(d)对所述的下胚轴切段进行再生，从而获得落叶松植物植株；在步骤(d)中，包括以下一个或多个独立的子步骤：(d1)对所述的下胚轴切段进行培养，获得愈伤组织；(d2)将所述愈伤组织置于含0.05‑10mg/l BA和0.01‑5mg/l NAA的低氮和/或低NH₄⁺培养基上，于23±1℃培养8‑12周，获得原始不定芽，即芽原基；(d3)将所述带有原始不定芽的愈伤组织置于含0.05‑10mg/l BA，0‑0.1mg/l TDZ和0.01‑5mg/lNAA的低氮和/或低NH₄⁺培养基上培养6‑8周，于23±1℃培养，诱导出形态清晰的不定芽；将所述清晰的不定芽置于含0‑6mg/l BA、0‑0.6mg/l NAA和0‑6mg/l GA₃的低氮和/或低NH₄⁺培养基上，于23±1℃培养，4‑6周后，得到伸长的不定芽；(d4)将所述伸长不定芽置于含有0‑6mg/l BA、0‑0.6mg/l NAA和0‑6mg/lGA₃的低氮和/或低NH₄⁺培养基上，于22±1℃进行暗培养2‑8天；将所述暗培养后的不定芽，去除形态学下端叶片，用5‑100mg/l IBA预处理0.2‑36h；所述预处理后的不定芽，切除形态学下端茎段，在含0.01‑5mg/l IBA的1/2MS培养基中继续培养；所述低氮和/或低NH₄⁺的培养基基于MS培养基的配方，对KNO₃、NH₄NO₃、NH₄Cl、和Ca(NO₃)₂·2H₂O的含量进行调整，其他成分不作调整；所述的“低氮”指所述培养基或培养条件的氮含量N_L与MS培养基中氮含量N0之比为0.35‑0.8；所述的“低NH₄⁺”指所述培养基或培养条件的NH₄⁺含量M_L与MS培养基中NH₄⁺含量M0之比为0.2‑0.7。