[发明专利]二肽肽酶I体外微量快速检测方法

摘要

二肽肽酶I(dipeptidyl peptidase,DPPI)是一种溶酶体半胱氨酸蛋白酶，高表达于免疫系统的颗粒细胞包括肥大细胞、中性粒细胞、粘膜T淋巴细胞。二肽肽酶I的释放和颗粒细胞的激活有关，而颗粒细胞的激活和一些炎症、自身免疫性疾病的发生有关。本发明是基于二肽肽酶I与其专属性底物相互作用后释放自由三氟甲基香豆素的原理，建立了一个二肽肽酶I活性检测的纸层析系统，纸层析结果表明二肽肽酶I的浓度和荧光强度正相关(图A)，可以作为一个体外微量快速检测的便携式新方法(图B)。本发明适用于人、大鼠和颗粒细胞的研究，特点是微量，无需血清制备，分析耗时短，易操作。

主权项

一种涉及到血液二肽肽酶I活性表达的体外快速检测方法，特征在于用于纸层析法进行检测，步骤如下：A.准备工作：底物XYZ1601的制备：以7‑氨基‑4‑三氟甲基香豆素与BOC‑苯丙氨酸通过生成酰胺的方法获得BOC‑苯丙氨酸‑三氟甲基香豆，在三氟乙酸的条件下脱去BOC保护，再与BOC‑甘氨酸反应，生成BOC‑甘氨酸‑苯丙氨酸‑三氟甲基香豆素，最后脱去BOC得到XYZ1601的方法；缓冲液的准备：XYZ1601‑‑DPPI专属底物0.5mM溶于缓冲液(25mM柠檬酸,10mM氯化钠，pH 6.0)；样液的准备：rhDPPI溶液、人鲜血和CIA大鼠眼眶取新鲜血液1μL，加入1.65μL的XYZ1601，37℃孵育10‑20分钟；展开剂准备：石油醚和二氯甲烷，比例为2:1配制成展开液；B.点样和层析：在纸层析用滤纸条的一端点加样品溶液，样品间距2.0cm，将点样后的滤纸在展开剂中展开；C.观察：展开剂前段接近纸层析条前沿时取出，风干后置于紫外灯下观察，紫外灯波长为365nm；D.DPPI活性的确认：测量原点至层析斑点距离，原点至溶剂前沿距离，计算Rf值，确认DPPI水解XYZ1601后释放的三氟甲基香豆素的位置，紫外灯下观察层析纸上黄绿色的亮斑大小和强弱，确定血液中DPPI的活性的大小。