[发明专利]基于超高效液相色谱‑轨道阱高分辨质谱的小鼠血液中香豆素及其代谢物的测定方法

摘要

一种基于超高效液相色谱‑轨道阱高分辨质谱的小鼠血液中香豆素及其代谢物的测定方法，其特征在于以4‑甲基伞形酮为内标，样品用乙腈沉淀蛋白后，直接进入XDB‑C18色谱柱分离和质谱仪分析，质谱采用一级全扫描和数据依赖二级扫描(Full MS/ddMS2)模式。香豆素是小鼠细胞色素P450 2A5（cytochrome P450 2A5，CYP2A5）的特异性底物，通过液质联用技术测定小鼠血液中7‑羟基香豆素的生成来评估CYP2A5酶活性的改变。该方法选择性好，分析效率高，操作简单、稳定快速，灵敏度高，重复性好，适合于小鼠血液中香豆素及其代谢物的检测与分析。

主权项

一种基于超高效液相色谱‑轨道阱高分辨质谱的小鼠血液中香豆素及其代谢物的测定方法，其特征在于：通过样品的采集及前处理、收集血液样品于离心管中，加入内标溶液，沉淀蛋白混匀离心后，采用超高效液相色谱‑轨道阱高分辨质谱UPLC‑Orbitrap HRMS分析检测小鼠血液中香豆素及其代谢物，根据试验结果测定香豆素及其代谢物并绘制相应的时间‑浓度曲线进行药代动力学分析，具体包括一些步骤：a、样品采集：小鼠通过腹腔注射CYP2A5探针药物香豆素溶液后眼眦取血约0.5 mL，置于1.5 mL离心管中，立即于4 ℃、6000 rpm下离心10 min；b、样品前处理：取100 μL上清血清至1.5 mL离心管内，加入20 μL浓度为100 ng/mL的内标溶液以及280 μL乙腈，涡旋30 s以充分混匀，超声10 min，于4 ℃、12 000 rpm下离心10 min，取上清液，用0.22 μm有机相针式滤器过滤，装入色谱瓶中待测；c、标准工作液的配制：使用甲醇溶解、乙腈定容，配制一系列浓度的香豆素、7‑羟基香豆素的混合标准工作溶液；d、定量分析：使用超高效液相色谱‑轨道阱高分辨质谱（UPLC‑Orbitrap HRMS）对混合标准工作溶液进行分析，得到线性回归方程，再对待测样品进行测定测得分析物与内标峰面积的比值，代入一元线性回归方程，求得样品中目标物的含量；色谱条件： Agilent Zorbax Eclipse XDB–C18色谱柱，规格150 mm×2.1 mm，3.5 µm；柱温25 ℃，进样量2 μL，流速0.2 mL/min；流动相A：0.1%甲酸水溶液，B:乙腈，A:B=70:30；质谱条件：使用Q‑Exactive轨道阱高分辨质谱系统的电加热喷雾离子源，喷雾电压3.5 kV，毛细管加热温度320 ℃，加热器温度300 ℃，鞘气流速1.67 L/min，辅助气流速1 L/min；扫描采用Full MS/ddMS2正离子模式，一级全扫描范围200±100 amu，分辨率7×104，离子最大注入时间50 ms，自动增益控制1×106；使用数据依赖扫描为二级扫描模式，分辨率为1.75×104，自动增益控制1×105，最大注入时间50 ms，归一化碰撞能量60%。