[发明专利]一种呼吸道合胞病毒单克隆抗体制备的方法

摘要

本发明提供了一种呼吸道合胞病毒单克隆抗体制备方法，该技术方案从近期感染呼吸道合胞病毒又康复者的外周血分离记忆性B细胞，进一步确定表达抗体的重链可变区和轻链可变区基因，利用鼠伤寒感受态细胞VNP20009直接转染293T细胞并使其在体外表达呼吸道合胞病毒单抗，经鉴定后评价其对呼吸道合胞病毒的中和能力和杀伤能力，从而筛选出高效、可规模化生产的呼吸道合胞病毒单克隆抗体。本发明直接以鼠伤寒感受态细胞VNP2009转染293T细胞，与传统方法相比不仅节省了时间而且还可避免使用大量的转染试剂。由于外源性质粒向表达系统的转染是单克隆抗体体外表达的关键环节，因此本发明对该技术的产业化应用提供了有力的支撑。

主权项

一种呼吸道合胞病毒单克隆抗体制备方法，其特征在于包括以下步骤：1)从呼吸道合胞病毒感染后又康复者的血清中提取记忆性B细胞，活化培养后通过酶联免疫方法筛选RSV抗体阳性细胞；2)提取RSV抗体阳性细胞的RNA，分别用一步法RT‑PCR方法扩增抗体重链可变区基因VH和轻链可变区基因Vκ或Vλ；3)将VH基因通过酶切法与恒定区载体质粒pIgH连接得到重链可变区基因重组质粒，将Vκ基因通过酶切法与恒定区载体质粒pIgκ连接或将Vλ基因通过酶切法与恒定区载体质粒pIgλ连接得到轻链可变区基因重组质粒；4)扩增步骤3)所得的重组质粒，而后筛选表达抗体重链和轻链的阳性质粒；5)制备减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009株的感受态细胞，取步骤4)所得的阳性质粒通过电转法导入其中，筛选阳性克隆，得到重组细菌；6)取HEK293‑T细胞与步骤5)所得的重组细菌，以二者的细胞量为1:20～1:200的比例在细胞培养板中混合，培养4～16h，而后将细胞培养板中的培养基更换为含有针对鼠伤寒沙门氏菌的抗生素的细胞培养基，培养40～56h。