[发明专利]一种用于肉鸡血清蛋白质组的鉴定方法

摘要

一种用于肉鸡血清蛋白质组的鉴定方法，包括如下步骤(1)血清样品的采集；(2)SDS‑PAGE电泳；(3)蛋白凝胶胶内酶解；(4)nano‑HPLC‑MS/MS对蛋白质的分析，所得数据通过Protein Pilot软件检索蛋白质数据库进行鉴定。利用本发明的方法可以快速、高通量地寻找到肉鸡血清蛋白表达的数量和种类，为进一步开展肉鸡营养、肉鸡免疫功能的研究提供方法和思路。

主权项

一种用于肉鸡血清蛋白质组的鉴定方法，其特征在于，实现步骤如下：(1)血清样品采集：收集n只正常肉鸡的血液，置于不含肝素的负压管中，负压管在冰上凝集15‑20min，在温度为4‑8℃、离心力为1600‑1800g条件下离心时间15‑20min后取上清液，即为所需的n个血清样品，获得的血清样品进行蛋白定量；(2)SDS‑PAGE电泳：①取10～30μg蛋白进行质量分数为10～15％的SDS‑PAGE电泳，电泳条件：60～90V，20～30min，90～110V电泳直到溴酚蓝到达凝胶前缘时即可结束电泳；②用考马斯亮蓝染色方法对步骤①获得的凝胶进行染色：将凝胶置于质量分数为0.1％R‑250染色液中，25‑40℃摇床上振荡染色1～2h，脱色液脱色30min～1h，超纯水水洗，每30‑40min换水一次，至凝胶背景脱净、条带清晰为止；所述染色液为乙醇、乙酸和水组成，其中乙醇和乙酸体积比在1:1～1:4，含质量分数为0.1～0.125％的R‑250，脱色液为乙醇、乙酸和水组成，其中乙醇和乙酸体积比在1:1～1:4；(3)蛋白凝胶胶内酶解：①高丰度蛋白40～70kDa，20～25kDa按照条带大小切成1～2mm3大小的胶块，其余蛋白条带按照分子量的分布分别切成1～2mm3大小的胶块；②步骤①中的凝胶用100‑200μl脱色液脱色2‑3次，15‑20min，可重复脱色，直到考马斯亮蓝颜色脱尽为止，弃上清，于真空浓缩冻干机中冻干凝胶；所述脱色液为体积比为50:50的乙腈和25‑100mM NH4HCO3溶液组成；③加入10‑15mM，体积100‑200μl DTT溶液，37‑56℃恒温箱中孵育45min‑1h，弃废液；④加入一定体积的50‑100mM碘乙酰胺溶液，使得碘乙酰胺的物质的量5倍于步骤③中所加DTT的物质的量，室温暗反应30‑45min，弃废液；⑤加入100‑200μl脱色液清洗2‑3次，每次10‑15min，于真空浓缩冻干机中冻干凝胶；⑥加入10‑15μl胰酶溶液，于4℃或冰水混合物上放置20‑30min，待凝胶溶胀；⑦加入15‑20μl,25‑100mM NH4HCO3溶液浸没凝胶，37℃‑40℃孵育过夜；⑧加入50‑100μl提取液，所述提取液为1‑5％甲酸溶液或三氟乙酸溶液，37℃‑40℃孵育30min‑1h，取上清转移至干净的离心管中；⑨胶块中再次加入50‑100μl提取液，所述提取液为体积比为50:50的乙腈和1‑5％甲酸溶液或三氟乙酸溶液；⑩步骤⑧和⑨的两次提取液合并，于真空浓缩冻干机中浓缩冻干，得到肽段样品；(4)样品质谱分析：将步骤(3)所获得的肽段样品，加入10‑15μl,0.1‑0.5％甲酸溶液，进行质谱分析，获得肽段及其碎片离子的质荷比。