[发明专利]雌三醇均相酶免疫检测试剂、制备方法及检测方法

摘要

本发明公开了雌三醇均相酶免疫检测试剂、制备方法及检测方法，属于免疫检测试剂技术领域。本发明制备的雌三醇免疫原，免疫原性高，可以诱导得到高效价的抗雌三醇特异性抗体，并且与常见的62种药物无任何交叉反应；由该抗体制备得到的雌三醇检测试剂，可以精确快速地确定尿液、血液等生物样品中的雌三醇含量。与市场上现有的检测试剂、检测方法、制备方法比较，本发明检测试剂具有操作简便、灵敏度高、特异性强、结果准确等优点，还能有效降低雌三醇检测成本，有利于临床大规模推广使用。

主权项

1.一种雌三醇均相酶免疫检测试剂的制备方法，其特征在于：所述的雌三醇均相酶免疫检测试剂含有抗雌三醇特异性抗体和指示试剂；所述的抗雌三醇特异性抗体为由雌三醇免疫原免疫实验动物后产生的完整抗体分子，或者为保留与雌三醇特异性结合能力的抗体片段或抗体衍生物；所述的雌三醇免疫原，其结构式如式（Ⅰ）所示： 式（Ⅰ）载体为具有免疫原性的蛋白质或多肽；所述的指示试剂为由雌三醇酶标偶联物和酶的底物组成的酶试剂，酶标偶联物为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原酶标偶联物，酶的底物为葡萄糖-6-磷酸；所述的雌三醇均相酶免疫检测试剂分为试剂A和试剂B；所述的雌三醇均相酶免疫检测试剂的制备步骤为：（1）试剂A：将2.018～8.072g、5.625～22.50 mM氧化态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和0.856～3.422g、5.625～22.50 mM葡萄糖-6-磷酸用0.5～2 L 55 mM、pH=8.0的Tris缓冲液溶解制成均相酶底物；将抗雌三醇特异性抗体加到上述均相酶底物中，抗雌三醇特异性抗体与均相酶底物的体积比为1: 200～1:7500；（2）试剂B：将雌三醇酶标偶联物加到120mM、pH=8.2的Tris缓冲液中，雌三醇酶标偶联物与Tris缓冲液的体积比为1:200～1:7500；其中，雌三醇酶标偶联物的制备方法包含以下步骤：（a）葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液的制备：称取7.5～22.5 mg规格为100KU的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，室温溶解于6～18 mL含有 72.6 mg 0.05 M Tris、8mg 3.3 mM MgCl2和100mgNaCl的溶液中， pH=8.5～9.0；在溶液中加入112.5～337.5 mg还原态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、67.5～202.5 mg 葡萄糖-6-磷酸以及0.375～1.125 mL卡必醇；加热到30-35摄氏度，再一次性加入1～3 mL 二甲基亚砜，摇匀后静置5-15s；（b）雌三醇衍生物的激活：在无水状态下称取5～15 mg 雌三醇衍生物，溶解于300～900 µL二甲基甲酰胺中；使上述溶液温度降到 -10 ~ -14℃；加入1.5～4.5 µL 三丁胺；加入0.75～2.25 µL氯甲酸异丁酯；加入0.1～2 µL 碳二亚胺EDC；5～15mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺；-10 ~ -14℃搅拌30～60分钟；（c）葡萄糖-6-磷酸脱氢酶与雌三醇衍生物的连接：将步骤（b）激活的温度为-10 ~ -14℃的雌三醇衍生物溶液逐滴加入到步骤（a）溶解的温度为30-35摄氏度的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液中；2-8℃搅拌过夜；（d）纯化产物：通过G-25凝胶层析柱纯化连接产物，获得的最终产物为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物，于2-8℃下储存；所述的雌三醇衍生物结构式如式（Ⅱ）所示： 式（Ⅱ）。