[发明专利]苹果潜隐病毒多重免疫胶体金检测试纸条的制备方法

摘要

本发明公开了一种苹果潜隐病毒多重免疫胶体金检测试纸条的制备方法，与现有技术相比，本发明旨在创制一种能够用以快速、特异、简便的检测苹果主要潜隐病毒的全新手段。研究成果不仅可以明确山西省苹果潜隐病毒的分子变异、侵染流行、毒力状况，而且基于上述研制的多重免疫胶体金试纸条能准确、快速的诊断苗木、砧木是否带毒，将有效控制该类病引发毒病的传播流行，提高苹果生产数量和产品质量。

主权项

一种苹果潜隐病毒多重免疫胶体金检测试纸条的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)器皿清洁：要用的所有玻璃器皿在流水下洗干净，放置到酸液中(重铬酸钾100g，浓硫酸50ml，加蒸馏水至1000ml)浸泡24h，用自来水反复冲刷，然后使用蒸馏水浸泡24h，用超纯水洗涤三次，再次使用超纯水浸泡72h，烤箱中干燥后备用；在配制试剂时一定要保持严格的纯净，所有试剂都要使用ddH20配制；(2)胶体金制备：取1％氯金酸水溶液1ml，加99ml超纯水，加热到沸腾，一边搅一边一次性快速滴加1.8ml新鲜配置的1％柠檬酸三钠水溶液，溶液颜色从黄逐渐转为紫红，再在沸水中加热3～5分钟，冷却到室温，加超纯水至原体积，4℃环境下保存备用，避免光照；(3)金标抗体的制备：将待标记抗体提前把0.005mol/lpH7.0的NaCl溶液中4℃透析过夜，从而除去多余的盐离子，10000rpm4℃离心30分钟，去除聚合物；测定待标记抗体最适用量：用0.1mol/l的K2CO3溶液调胶体金溶液的pH值到8.5，分装10管，每管1ml，分别滴加2μl、4μl、6μl、8μl、10μl、20μl抗体，充分混合均匀后每管滴加10％(m/v)的NaCl溶液0.1ml；另设对照管，即1ml胶体金中只加0.1ml10％的NaCl溶液，混合均匀后放置2小时，观察结果；用0.1mol/l的K2CO3将胶体金溶液的pH值调至8.5；搅动过程下，向金溶胶内滴加最佳标记含量的抗体，均匀搅动2～3分钟；滴加10％的BSA作为稳定剂，使其终浓度为1％，继续搅拌15分钟，4℃保存备用；将金标抗体溶液在1200rpm、4℃离心10分钟从而清除其中的胶体金聚合物，取上清液，再用14000rpm、4℃离心50分钟，可见离心物分成3层，上清液中含有还没有结合的抗体，没有结合的胶体金颗粒聚合物在最底层形成深黑色斑点，中部紫红色絮状沉淀是良好结合的胶体金—抗体复合物；弃去上清，把紫红色絮状沉淀溶于1/10原体积的含1％BSA的PBS缓冲液(0.01mol/l，pH8.2)中，4℃保存备用；(4)试纸条的组装：将裁剪好的玻璃纤维膜放入含1％BSA的0.01mol/l的PBS中封闭1h，待自然晾干后，将适当稀释过的不同金标抗体等体积混合后均匀滴加在玻璃纤维素膜上至饱和，37℃烘箱中烘干备用；分别取已经纯化过的抗体和羊抗兔抗体用PBST缓冲液进行一定的稀释，分别在硝酸纤维素膜上滴加样品于T线和C线上，室温晾干后，放在封闭溶液里，37℃环境中进行1h孵化培育，用PBST缓冲液洗2次，每次5分钟，在正常室内温度晾干保存；抗体固相硝酸纤维素膜、滤纸、金标抗体结合释放垫、样品垫按照顺序安在PVC板上，相互间留1～2mm的重叠，用力压紧，避免产生气泡；4℃避光干燥保存；(5)试纸条检测：取经RT‑PCR验证过的感染病毒的苹果叶片，称重后放在干净研钵中，依照1:10(m/v)的比例滴加PBST，进行研磨并成为匀浆，2000rpm离心10分钟，取上清液作为样品分别用试纸条检验，再把相同量的样本混合均匀，拿试纸条检验。