[发明专利]西伯利亚杏体细胞胚胎发生的方法

摘要

本发明为一种西伯利亚杏体细胞胚胎发生的方法，属于植物栽培领域种苗技术，具体的讲是利用西伯利亚杏成熟胚诱导体细胞胚胎发生的方法。本发明采用完全成熟的西伯利亚杏种子，取成熟胚为外植体材料，接种到愈伤诱导培养基上培养，诱导产生胚性愈伤，将上述愈伤增殖从而能达到扩繁目的，再由胚性愈伤进行进一步诱导,使其分化形成上期原胚，由早期原胚在一定条件下同步化培养，促使其发育同步化，已同步化培养的早期原胚进一步成熟，形成具备可正常萌发条件的体细胞胚：本发明的优点是，采用本发明获得了大量的西伯利亚杏体细胞胚，实现西伯利亚杏优良品种的快速繁殖。

主权项

1.一种西伯利亚杏体细胞胚胎发生的方法，其特征在于包括如下步骤：（1）将成熟的西伯利亚杏种子用刷子刷去表面残渣，以3%高锰酸钾溶液浸泡12小时后，自来水冲洗3遍，在干净的环境下破壳，取出西伯利亚杏种仁。在超净工作台中，先用无菌水将种仁冲洗三遍，用75%酒精浸泡30s后用无菌水清洗3‑5次,再用 2%次氯酸钠溶液消毒3 min,然后用无菌水冲洗3‑5次；（2）将经步骤（1）处理过的种子以手术刀剥取完整的种胚后，接种于下列培养基中：B5培养基+6‑BA0.3mg/L+2,4‑D0.9mg/L+KT0.25mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L，pH控制在5.8～6.0、温度为23±2℃、暗条件下进行诱导培养35天生成愈伤组织；（3）将步骤（2）所述的愈伤组织接种于以下培养基中：B5培养基+NAA0.5mg/L+ KT0.2mg/L+蔗糖20g/L+ 还原型谷胱甘肽100mg/L+琼脂6g/L，pH控制在5.8～6.0、温度为23±2℃、暗条件下进行继代培养30天诱导产生胚性愈伤组织；（4）将步骤（3）所述的胚性愈伤组织接种于下列培养基中：B5培养基+NAA0.2mg/L +蔗糖20g/L+水解乳蛋白500mg/L+琼脂6g/L，pH控制在5.8～6.0、温度为23±2℃、暗条件下进行增殖培养，每隔30天以相同配方继代培养进行增殖；（5）将步骤（4）所述的增殖得到的胚性愈伤组织接种于下列培养基中：B5培养基+6‑BA0.5mg/L+NAA1.0mg/L+蔗糖20g/L+水解酪蛋白800mg/L+谷氨酰胺200mg/L+琼脂6g/L，pH控制在5.8～6.0、温度为23±2℃、暗条件下进行分化培养30天；（6）将步骤（5）所述的分化培养得到的上期原胚接种于下列培养基中：B5培养基+ABA1.5mg/L+蔗糖55g/L+水解酪蛋白800mg/L+谷氨酰胺200mg/L+肌醇500mg/L+琼脂6g/L，pH控制在5.8～6.0、温度为23±2℃、暗条件下同步化培养15天，使上期胚胎发生发育达到同步化，得到同步化体细胞胚 ；（7）将步骤（6）所述的同步化体细胞胚接种于B5培养基+蔗糖30g/L+琼脂6g/L，pH控制在5.8～6.0、温度为23±2℃、暗条件下培养20天后，体胚发育成熟，达到萌发的指标，得到分化成熟体细胞胚；（8）将步骤（7）所述的分化成熟体细胞胚接种于1/2WPM培养基+蔗糖20g/L+琼脂6g/L, pH控制在5.8～6.0、温度为23±2℃、3000Lx光照条件下培养30天后即可长成根茎叶健全的健壮西伯利亚杏幼苗。