[发明专利]一种肾阴虚证动物模型生物标志物的筛选及确定方法

摘要

本发明提供一种肾阴虚证动物模型生物标志物的筛选及确定方法，具体包括样品皮质骨总蛋白的提取、蛋白浓度的测定、双向凝胶电泳分析、凝胶蛋白点的检测与差异蛋白点显示分析、差异蛋白的MALDI‑TOF‑MS质谱分析以及蛋白质数据库检索及鉴定、确定差异蛋白、通过Western‑Blot、RT‑PCR对部分差异蛋白质进行鉴定并与血清中的差异蛋白ELISA检测结果互相验证，表达趋势一致且在正常值范围之外的差异蛋白可以用作肾阴虚证动物模型鉴定的生物标志物。本发明有助于为动物实验中肾阴虚证型提供判别指标；为进一步发现肾阴虚生物标志物提供基础。

主权项

1.一种肾阴虚证动物模型生物标志物的筛选及确定方法，其特征在于，其具体步骤如下：（1）肾阴虚证大鼠模型的建立；（2）差异蛋白的筛选；（3）对部分与肾阴虚证相关差异蛋白的验证；（4）肾阴虚证动物模型生物标志物的确定；所用于构建动物模型的大鼠为WISTAR大鼠；所述差异蛋白筛选的具体步骤如下：a) 大鼠皮质骨总蛋白的提取；b) 测定蛋白浓度；c) 双向凝胶电泳分析；d) 凝胶蛋白点的检测与差异蛋白点显示分析；e) 差异蛋白的MALDI‑TOF‑MS质谱分析；f) 蛋白质数据库检索及鉴定，确定差异蛋白；所述部分与肾阴虚证相关差异蛋白的验证方法如下：a) 应用Western‑Blot方法从蛋白质水平对标志物进行验证；b) 应用RT‑PCR方法从基因水平对标志物进行验证；RT‑PCR中采用的基因引物为：Apoal‑F：AAGGACAGCGGCAGAGACTATG，Apoal ‑R：TCATCTCGTTTCTCAGCCAATC；Arhgdib‑F：TTAGCCTTGTTTGTGACAGTGC，Arhgdib ‑R：CTTGTTGTGGTAAGTGCCTCG；Hspdl‑F:GGCTGTGCTCTACTTCGGTG，Hspdl‑R:CAGCATCCAGTAAAGCAGTTCT;GAPDH‑F：ACGGCAAGTTCAACGGCACAG，GAPDH‑R：GAAGACGCCAGTAGACTCCACGAC；所述肾阴虚证动物模型生物标志物的确定方法为：将血清蛋白的ELISA检测结果与 Western‑Blot、RT‑PCR检测结果对比分析，选取表达趋势一致且在正常值范围之外的差异 蛋白作为生物标志物；最终确定的用作肾阴虚证的血清标志物为鸟嘌呤核苷酸解离抑制因子β，且与正常组比较，肾阴虚证大鼠鸟嘌呤核苷酸解离抑制因子β表达下降。