[发明专利]以甘蓝型油菜下胚轴为外植体获得悬浮细胞系的方法及其应用

摘要

本发明属于植物细胞培养技术领域。具体涉及以甘蓝型油菜下胚轴为外植体获得悬浮细胞系的方法及其应用。本发明以甘蓝型油菜无菌下胚轴为外植体，通过胚性愈伤组织的诱导，悬浮细胞的培养等步骤建立了甘蓝型油菜悬浮细胞系，并利用该体系研究比较了必需微量营养元素正常和缺乏条件下悬浮细胞的形态和活性差异。本发明所制备的甘蓝型油菜悬浮细胞活性高，形态稳定均一，培养周期短，不受季节、气候等自然环境因素的限制，可用于甘蓝型油菜单细胞水平上细胞发育、以及在非生物胁迫下细胞生长、形态形貌、养分跨膜转运、生理生化代谢和基因表达等方面的研究与应用。

主权项

1.一种以甘蓝型油菜(Brassica napus L.)下胚轴为外植体获得悬浮细胞系的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)外植体的消毒：将清水浸泡过夜的甘蓝型油菜种子倒入三角瓶中，加75％的酒精灭菌30s，再用0.1％的氯化汞灭菌10min，用无菌水冲洗4～5次，将灭菌后的甘蓝型油菜种子播种于播种培养基上，所述的播种培养基以B5培养基为基础培养基，附加30g/L蔗糖和10g/L琼脂，补充蒸馏水至1L，调培养基的pH至5.8-5.9，于24℃下暗培养5-7天，获得甘蓝型油菜无菌苗；(2)愈伤组织的诱导：将甘蓝型油菜无菌苗的下胚轴切成0.5～1cm茎段,接种到愈伤组织诱导培养基上，于24℃下暗诱导得到甘蓝型油菜的愈伤组织；(3)愈伤组织的继代：将30日龄的甘蓝型油菜愈伤组织剔除褐化和老化的愈伤组织，转移至愈伤组织继代培养基上，于24℃下暗培养，继代培养1～2次，每次继代14-16天；(4)悬浮细胞系的建立：将颜色淡黄、质地疏松的胚性愈伤组织转移至悬浮细胞培养基上，每150mL的三角瓶装30mL悬浮细胞培养基，每瓶接种1g颜色淡黄和质地疏松的胚性愈伤组织，在25℃，转速为120r/min和暗培养的条件下培养，得到悬浮细胞系；其中：步骤(2)所述的愈伤组织诱导培养基的配制：以B5培养基为基础培养基，附加2.0mg/L的2,4-D，0.5mg/L的6-BA，30g/L的蔗糖，0.1g/L柠檬酸，300mg/L的水解酪蛋白，500mg/L的L-脯氨酸和8g/L琼脂，补充超纯水至1L，调培养基的pH至5.8-5.9；步骤(3)所述的愈伤组织继代培养基的配制：以B5培养基为基础培养基，附加2.0mg/L的2,4-D，0.5mg/L的6-BA，30g/L的蔗糖，0.1g/L柠檬酸，300mg/L的水解酪蛋白，500mg/L的L-脯氨酸和8g/L琼脂，补充超纯水至1L，调培养基的pH至5.8-5.9；步骤(4)所述的悬浮细胞培养基的配制：以改良的B5培养基为基础培养基：二水氯化钙440mg/L，磷酸二氢钾170mg/L，硫酸镁370mg/，氯化钾2940mg/L，碘化钾0.83mg/L，六水氯化钴0.025mg/L，硼酸6.2mg/L，二水钼酸钠0.25mg/L，一水硫酸锰16.9mg/L，五水硫酸铜0.025mg/L，七水硫酸锌8.6mg/L，肌醇100mg/L，盐酸硫胺素0.5mg/L，乙二胺四乙酸二钠37.25mg/L，七水硫酸亚铁27.85mg/L，附加3mg/L的2,4-D，266mg/L的L-天冬氨酸，877mg/L的L-谷氨酰胺，228mg/L的L-精氨酸，75mg/L的甘氨酸，25g/L的蔗糖，0.1g/L的柠檬酸，补充超纯水至1L，调培养基的pH至5.8-5.9。