[发明专利]一种铁皮石斛的复合菌剂

摘要

本发明属于生物菌肥技术领域，具体涉及一种铁皮石斛的复合菌剂，包括根内放线菌的分离纯化，拮抗放线菌的筛选，促生菌根真菌的放线菌筛选，促生放线菌种属地位确定，优化菌根真菌协同放线菌促进铁皮石斛无性苗生长的复合菌剂。本发明利用铁皮石斛菌根真菌协同其根内放线菌得到的复合菌剂，能够刺激铁皮石斛细胞产生高效的防御能力，增强铁皮石斛自身修复、抗病性、抵抗极端环境及提高其无性苗成活率能力，促进铁皮石斛无性苗的生长，为规模化生产优质铁皮石斛种苗提供技术支持。

主权项

一种铁皮石斛的复合菌剂，其特征在于，其制作工艺按照以下步骤进行：（1）根内放线菌的分离纯化：A．选取健康新鲜铁皮石斛营养根系，将根样用纱布包好经流动自来水冲洗干净；B．置于75%乙醇中消毒20s，无菌水冲洗2‑3次，再用0.1%升汞溶液消毒20s，无菌水冲洗4‑5次，使用灭菌滤纸将根样表面水分吸干；C．设置空白对照试验，即用消毒完的根样置于高氏一号培养基上滚动数次；D．将表面已消毒根样，置于超净工作台中研磨成匀浆，微波处理30S，混匀后分别稀释成10‑1、10‑2、10‑3根样稀释液，分别接种于高氏一号、TWYE、YIM38#三种培养基平板中，置于28℃恒温培养箱中倒置培养7‑15天；E．对照空白培养基若无菌落生成，则表明根样表面消毒合格，将分离出的放线菌菌落挑出，多次纯化，得到放线菌菌株，置于4℃冰箱中保存备用；（2）拮抗放线菌的筛选：A．采用平板对峙法，将供试铁皮石斛病原真菌极细链格孢菌、砖红镰孢菌、层出镰孢菌、灰葡萄孢菌、齐整小核菌接种于PDA培养基中，28℃恒温培养5天，打取直径5mm的病原菌菌块接种于高氏一号培养皿中央，在同一水平线上，与病原菌同等距离的位置两侧，接种同等大小的放线菌菌块，每个处理重复3次实验；B．以培养皿中央只接种病原真菌，两侧不接种放线菌为对照，每个处理重复3次，待对照病原真菌长满培养皿，测定放线菌对5种病原真菌的抑制率，筛选对病原真菌具有明显拮抗作用的放线菌菌株；（3）促生菌根真菌的放线菌筛选：A．将上述筛选出的促生放线菌分别与两种供试铁皮石斛促生菌根真菌瘤菌根菌属和胶膜菌属，在高氏一号培养基中进行平板对峙试验，每个处理重复3次实验；B．以培养皿中央只接种菌根真菌为对照，每个处理同样重复3次，待对照菌根真菌长满培养皿，测定放线菌对菌根真菌抑制率，筛选出对铁皮石斛菌根真菌具有明显促生作用的放线菌；（4）促生放线菌种属地位确定：采用分区划线法、插片法观察上述筛选出的放线菌的形态显微结构特征，采用16S rDNA PCR扩增分析，鉴定促生放线菌为克兰斯基链霉菌；（5）优化菌根真菌协同放线菌促进铁皮石斛无性苗生长的复合菌剂：A．选取4个月苗龄的铁皮石斛无性苗，接种于Harvaris培养基中，培养15天；B．将促生放线菌克兰斯基链霉菌与供试铁皮石斛促生菌根真菌瘤菌根菌属和胶膜菌属按照1:1:1的比例接种在无污染的健康无性苗中进行共生培养，培养60天。