[发明专利]一种检测、筛选及鉴定肾阳虚证代谢生物标记物的方法

摘要

一种检测、筛选及鉴定肾阳虚证代谢生物标记物的方法，本发明涉及检测、筛选及鉴定代谢生物标记物的方法。本发明是要解决现有技术不能确定肾阳虚证的生物标记物的问题，而提出的一种检测、筛选及鉴定肾阳虚证代谢生物标记物的方法。该方法是通过复制肾阳虚证大鼠模型；评价肾阳虚证大鼠模型；制备得到大鼠尿液或血液QC样本；得到尿液内源性代谢物和血液内源性代谢物；大鼠尿液代谢轮廓轨迹的变化趋势PCA得分图确定鉴定得到尿液生物标记物33个，血液生物标记物17个等步骤实现的。本发明应用于检测、筛选及鉴定代谢生物标记物领域。

主权项

1.一种检测、筛选及鉴定肾阳虚证代谢生物标记物的方法，其特征在于，该方法具体是按照以下步骤进行的：步骤一、复制肾阳虚证大鼠模型；将清洁级大鼠完全随机分成2组，即正常组和模型组；正常组每只大鼠按0.1mL/Kg体重皮下注射橄榄油溶液，模型组每只大鼠按0.1mL/Kg体重皮下注射10mg/mL皮质酮橄榄油溶液；采集正常组和模型组清洁级大鼠的尿样样本、血液样本和脏器样本；步骤二、评价肾阳虚证大鼠模型；计算血清和尿液样本的各生化指标的相应浓度、大鼠体重数据、脏器指数以及免疫组织化学指标；根据各指标具有极显著性差异，确定复制的肾阳虚证大鼠模型；步骤三、将大鼠原始浓度尿液制备得到大鼠尿液QC样本；将步骤一得到的采集正常组及模型组清洁级大鼠的尿样样本制备得到大鼠的尿液样本；所述原始浓度尿液指的是未经注射药物的大鼠采集的尿液；步骤四、将大鼠原始浓度血液制备得到大鼠血液QC样本；将步骤一得到的采集正常组及模型组清洁级大鼠的血液样本制备得到大鼠血液样本；所述原始浓度血液指的是未经注射药物的大鼠采集的血液；步骤五、分别将步骤三得到的大鼠尿液QC样本和大鼠的尿液样本以及步骤四得到的大鼠血液QC样本和大鼠血液样本进行高效液相色谱柱梯度洗脱得到大鼠样本的尿液内源性代谢物和血液内源性代谢物；步骤六、将步骤五中得到的尿液内源性代谢物和血液内源性代谢物分别进行正离子扫描模式和负离子扫描模式下的质谱分析，得到大鼠尿液样本的代谢轮廓信息和大鼠血液样本的代谢轮廓信息；步骤七、利用模式识别分析‑主成分分析方法将步骤六得到的大鼠尿液样本的代谢轮廓信息和大鼠血液样本的代谢轮廓信息进行分析得到正常组大鼠尿液、模型组大鼠尿液、正常组大鼠血液以及模型组大鼠血液的代谢轮廓轨迹的变化趋势PCA得分图；步骤八、根据步骤七得到的正常组大鼠尿液与模型组大鼠尿液代谢轮廓轨迹的变化趋势PCA得分图确定肾阳虚证大鼠模型尿液潜在生物标记物；步骤九、根据步骤七得到的正常组大鼠与模型组大鼠血液代谢轮廓轨迹的变化趋势PCA得分图获得肾阳虚证大鼠模型血液潜在生物标记物；步骤十、鉴定肾阳虚证潜在生物标记物，根据肾阳虚证大鼠尿液和肾阳虚证大鼠血液潜在生物标记物保留时间和质核比信息进行代谢物库的匹配；通过高效液相色谱以及质核比MS/MS数据来确定标记物的化学结构；共鉴定得到尿液生物标记物33个，血液生物标记物17个；所述33个尿液生物标记物鉴定结果分别为：12‑羟基十二烷酸、乙酰基‑L‑酪氨酸、N‑乙酰血清素、黄尿酸、马尿酸、二碘羟基喹啉、氢化肉桂酸、牛磺酸、烟酰胺、11β，21‑二羟基‑5β‑孕酮‑3,20‑二酮、肌酐、胸苷、胞嘧啶、3‑甲醛吲哚、醛赖氨酸、犬尿酸、3‑甲氧基肾上腺素、羟苯基乙酰甘氨酸、N‑丁二酰‑L‑谷氨酸‑半醛、L‑缬氨酸、3‑羟基十二碳二酸、泛酸、癸二酸、苯丙酮酸、尿酸、α‑亚麻酸、苯乙酰甘氨酸、葡萄糖醛酸内酯、N‑乙酰‑L‑精氨酸、酮戊二酸、尿囊素、N‑乙酰神经氨酸、吡咯啉羧酸；所述17个血液生物标记物鉴定结果分别为：9,12,15‑十八碳三烯酸甲酯、皮质酮、亚麻酸、L‑色氨酸、棕榈酰胺、LysoPC(16:1(9Z))、LysoPC(15:0)、PC(17:1(9Z)/0:0)、表脱氧胆酸、硫酸吲哚酚、棕榈酰肉碱、1‑磷酸‑鞘氨醇、尿苷、牛磺胆酸、PE(19:0/0:0)、LysoPC(20:4(5Z,8Z,11Z,14Z))、LysoPE(18:0/0:0)；其中，匹配原则：一级质量数结合质谱IDA采集得到的二级数据与代谢物库进行匹配；在步骤一中，所述采集正常组和模型组清洁级大鼠的尿样样本具体为：采集每只大鼠12h的尿样，将新鲜尿样于4℃、13000rpm离心10min后在‑80℃贮存，进行分析之前室温解冻；在步骤一中，所述采集正常组和模型组清洁级大鼠的血液样本具体为：1)每只大鼠均于腹主动脉采集血液，在离心4℃，4000r/min，10min条件下分离血清；2)分装后冻存于‑80℃冰箱，进行分析之前室温解冻；在步骤一中，所述采集正常组和模型组清洁级大鼠的脏器样本具体为：①采集每只大鼠经腹主动脉血样后，迅速取出肾上腺、胸腺、睾丸并用分析天平称重，计算各脏器的脏器指数；②下丘脑与垂体在大鼠灌注4％多聚甲醛溶液后，将下丘脑、垂体、肾上腺、甲状腺和睾丸共同置于4％多聚甲醛溶液固定备用；步骤三中将大鼠原始浓度尿液制备得到大鼠尿液QC样本；将步骤一得到的采集正常组及模型组清洁级大鼠的尿样样本制备得到大鼠的尿液样本具体为：步骤三一、按照步骤一尿液样本的采集方法采集大鼠原始浓度尿液，从大鼠原始浓度尿液中各取200μL，混合后涡旋10s后分装后得到大鼠尿液待处理样本，‑80℃保存；步骤三二、在室温下解冻步骤三一的大鼠尿液待处理样本和步骤一得到的采集正常组及模型组清洁级大鼠的尿样样本，并利用4倍体积的蒸馏水进行稀释，涡旋10s后，在4℃、13000rpm条件下离心10min，过0.22μm滤膜，得到大鼠尿液QC样本和大鼠的尿液样本；步骤四中将大鼠原始浓度血液制备得到大鼠血液QC样本；将步骤一得到的采集正常组及模型组清洁级大鼠的血液样本制备得到大鼠血液样本具体过程为：步骤四一、按照步骤一血液样本采集方法从每只大鼠腹主动脉采集原始浓度血液50μL，混合后涡旋10s后得到大鼠血液QC待处理样本；步骤四二、在室温下解冻步骤四一血液QC待处理样本和步骤一得到的采集正常组和模型组清洁级大鼠的血液样本后，涡旋10s，取200μL上层血清置于1.5mL离心管中，加800μL甲醇，涡旋10s，超声1min，13000rpm离心10min，取上清液850μL，于40℃水浴下氮气吹干，残渣用200μL 80％甲醇复溶，4℃、13000rpm离心10min，过0.22μm滤膜，取上清液即得大鼠血液QC样本和处理后的血液样本；步骤五所述进行高效液相色谱柱梯度洗脱采用的色谱条件为：流动相：A为0.1％甲酸‑水，B为0.1％乙腈水；柱温：40℃；流速：0.4ml/min；进样量：3μL；步骤六中所述的正离子扫描模式条件为：离子喷雾电压：5.5KV；离子源温度：600℃；解簇电压(DP)：100V；碰撞能量：35eV；氮气为雾化气和辅助气：雾化气55psi，辅助气55psi，气帘气35psi；在质核比m/z在100‑1200amu质量范围ESI正离子模式下进行全扫描，积累时间250ms；负离子扫描模式：离子喷雾电压：4.0KV；离子源温度：600℃；解簇电压(DP)：100V；碰撞能量：35eV；氮气为雾化气和辅助气：雾化气65psi，辅助气65psi，气帘气35psi；在m/z为100‑1200amu质量范围ESI负离子模式下进行全扫描，积累时间250ms；IDA采用标准：每个分析物，超过100cps的八个最强的碎片离子在100～1200amu质量范围内进行子离子扫描，累积时间为100ms；碰撞电压差为15eV；步骤八中根据步骤七得到的正常组大鼠尿液与模型组大鼠尿液代谢轮廓轨迹的变化趋势PCA得分图确定肾阳虚证大鼠模型尿液潜在生物标记物具体过程为：步骤八一、在PCA得分图中显示正常组大鼠与模型组大鼠尿液代谢数据完全分离后，对正常组与模型组的代谢数据矩阵进行模式识别分析‑正交偏最小二乘法分析，选取一定VIP值进行潜在生物标记物的初步筛查；步骤八二、以代谢物微观含量变化趋势一致且满足正常组与模型组组间大鼠尿液各代谢物具有显著性差异P<0.05的原则，将潜在生物标记物进行第二次筛选获得第二次潜在标记物，步骤八三，获得的初步筛查的潜在标记物和第二次潜在标记物为肾阳虚证大鼠模型尿液潜在生物标记物；步骤九中根据步骤七得到的正常组大鼠与模型组大鼠血液代谢轮廓轨迹的变化趋势PCA得分图获得肾阳虚证大鼠模型血液潜在生物标记物具体过程为：步骤九一、在确认PCA得分图显示两组完全分离后，对正常组与模型组的代谢数据矩阵进行模式识别分析‑正交偏最小二乘法分析，通过VIP值进行潜在生物标记物的初步筛查；步骤九二、满足正常组与模型组组间大鼠血液各代谢物具有显著性差异P<0.05的原则进行第二次潜在标记物筛选，步骤九三、初步筛查的潜在标记物和第二次潜在标记物作为肾阳虚证大鼠模型血液潜在生物标记物。