[发明专利]一种高纯青蒿素的生物提取方法

摘要

本发明涉及一种高纯无生物毒性青蒿素的制备方法，属于植物药有效成分提取技术领域。本发明通过制备出一种无菌复合培养基，将含有青蒿素的黄花蒿接种培养，以吲哚乙酸导流，富集于叶片，经腐烂、水解、发霉、最终收集霉菌，过柱洗脱，蒸馏得一种无生物毒性的青蒿素选本发明将富集青蒿素的叶片进行水解，叶片中植物蛋白水解形成的多肽和氨基酸与青蒿素中过氧基团进行复合，改善青蒿酸生物毒性，可使青蒿素安全性大大增强，从而降低对生物安全的威胁。本发明制得的青蒿素可使疟原虫对异亮氨酸的摄入量减少90%以上，制得的青蒿素人体过敏率低于0.5%，安全性较强，且提取青蒿素原料环保无公害，对环境无污染。

主权项

一种高纯青蒿素的生物提取方法，其特征在于具体步骤为：（1）选取黄花蒿嫩叶片，用清水洗涤3～5次后，自然晾干，收集干燥黄花蒿嫩叶片，按质量比1:8，将其与质量分数75%乙醇溶液搅拌混合，浸泡处理3～5h后，用紫外灯灭菌处理10～15min，随后在无菌条件下，将灭菌处理后的叶片切割至大小为1.0cm2的嫩叶叶片，备用；（2）按重量份数计，分别称量1～2份六苄氨基嘌呤、2～3份激动素、2～3份吲哚乙酸和3～5份2,4‑二氯苯氧乙酸和15～20份去离子水置于烧杯中，搅拌混合收集得激素调节液，按质量比1:5;25，将激素调节液、豆粕和MS培养基混合，制备得初级培养基；（3）将上述制备的初级培养基置于28～32℃发酵处理2～3天，过滤并收集滤液，在120～125℃下灭菌处理10～15min，在3500～4000r/min下离心分离10～15min，收集上层清液，再按质量比1:10，将纯度≥97%的青蒿素与上层清液搅拌混合，在45～50℃下水浴加热1～2h，制备得青蒿酸混合液；（4）按质量比1:5.将上述制备的青蒿酸混合液与MS培养基搅拌混合，紫外灯灭菌处理10～15min，制备得无菌复合培养基，按质量比1:25，将步骤（1）制备的嫩叶叶片接种至无菌复合培养基上，随后每隔24h，按0.05g/cm2施加量，将3g/L吲哚乙酸无水乙醇溶液淋洒至嫩叶叶片表面，在24～28℃下弱光培养10～12天，控制光强为15～20Lx；（5）待培养完成后，收集叶片并密封发酵5～7天，待发酵完成后，将其捣碎并质量4500～6000r/min离心分离10～15min，随后过滤并收集上层清液，，将上层清液通过Sephadex LH‑20凝胶柱进行洗脱处理，控制凝胶柱中流动相为甲醇‑氯仿混合液，甲醇：氯仿=7:3，待洗脱完成后收集得油状物，即得一种高纯青蒿素。