[发明专利]敲除自溶链霉菌野生型菌株的almRIII基因、发酵提高洋橄榄叶素及衍生物产量的方法

摘要

敲除自溶链霉菌野生型菌株的almRIII基因、发酵提高洋橄榄叶素及衍生物产量的方法，属于微生物突变的基因工程及发酵方法。本发明通过敲除自溶链霉菌(Streptomyces autolyticus)△almRIII基因以获得突变株，该自溶链霉菌(Streptomyces autolyticus)保藏编号为CCTCC NO：M 2015580。进一步，采用Red/ET一步PCR法构建了almRIII基因的插入突变，并通过同源重组获得其敲除突变株；并将所构建的敲除突变株进行发酵提高洋橄榄叶素及其衍生物的产量，以及HPLC检测和质谱及¹H、¹³C核磁共振分析发酵产物等。本发明可大幅提高合成洋橄榄叶素及其衍生物的产量。

主权项

1.敲除自溶链霉菌野生型菌株的almRIII基因的方法，其特征在于：敲除保藏编号为CGMCC 0516的自溶链霉菌(Streptomyces autolyticus)almRIII基因以获得突变株，所述almRIII基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述方法包括以下步骤：(1)采用Red/ET一步PCR法，以质粒pHY773为模板，通过PCR扩增获得两端带有与almRIII基因同源序列的aac(3)IV基因插入盒；PCR扩增的引物为：5′‑TATTGGCTGACAGCCAGCCAACGCAGGAGTTACAGCATGATTCCGGGGATCCGTCGACC‑3′和5′‑GGGCCCGTCCCTCACCCATGAGTCACCTCTGAGTGCTCATGTAGGCTGGAGCTGCTTC‑3′；PCR扩增条件为：94℃预热2分钟，1个循环；94℃变性45秒，62℃复性45秒，72℃扩增2分钟，31个循环；72℃扩增10分钟；4℃1小时；(2)通过电转化把所扩增片段导入含pIJ790和almRIII基因粘粒质粒的Escherichia coli大肠杆菌中，筛选阿泊拉霉素抗性的转化子，该转化子即为含有插入突变的almRIII基因；(3)用上述转化子制备含有插入突变的almRIII基因的粘粒质粒，通过电转化导入大肠杆菌ET12567/pUZ8002中；(4)利用接合转移把含有插入突变的almRIII基因的粘粒质粒导入野生型自溶链霉菌中，筛选阿泊拉霉素抗性和硫链丝菌素敏感的接合转移子，即自溶链霉菌almRIII基因敲除突变株。