[发明专利]快速检测组织或者线虫中ATP、ADP、AMP、CP以及creatine含量的方法

摘要

本发明涉及一种快速检测组织或者线虫中ATP、ADP、AMP、CP以及creatine含量的方法，包括标准溶液的配制、分析样品的配制和精密度试验等步骤，样品注入LC‑MS/MS，用外标法测定组织或者线虫中的ATP、ADP、AMP、CP以及creatine含量，解决了同时监控ATP、ADP、AMP、CP、以及creatine的难题，避免了对5种成分多次检测的时间和试剂耗费，并可进一步作为其它生物体中ATP、ADP、AMP、CP、以及creatine含量测定的方法。

主权项

一种快速检测组织或者线虫中ATP、ADP、AMP、CP以及creatine含量的方法，其特征是，包括如下工艺步骤：(1)标准溶液的配制分别精密称取2mg ATP、ADP、AMP、CP和creatine标准品,分别用1mL超纯水溶解，避光‑80℃保存；取各标准品溶液50μL混匀，用体积比为1:1的甲醇和水依次稀释20、40、80、100、160、200、640倍后绘制标准曲线；取组织或者线虫，液氮状态下研碎混匀或者加高氯酸溶液匀浆，加入不同浓度的ATP、ADP、AMP、CP和creatine标准溶液混匀，分别配制成自10.0到50000.0不同梯度浓度的混合标准组织液体样品；前述所有操作均在4℃以下进行；标准曲线与线性范围采用外标法定量；(2)分析样品的配制组织用灵敏度为0.0001g的电子分析天平称重后，迅速置于预冷的玻璃组织研磨器中液氮状态下研碎混匀或者用匀浆器打碎,加入10倍量的4℃预冷的甲醇，漩涡混匀2min；再4℃低温离心离心，14000转/分钟，15min，取上清液；上清液用4℃预冷的体积比为1:1的甲醇和水稀释10倍，高速离心14000转/分钟，再次取得的上清液，即为供试品溶液，‑80℃储存待测；收集线虫，用浓度为0.1mol/L的高氯酸溶液在冰浴下充分匀浆，取全部匀浆液于4℃、14000r/min离心10min，取出上清液重复离心一次，并用0.22μm微孔滤膜过滤后,‑80℃储存待测；(3)精密度试验精密吸取5种化合物混合标准品溶液，加入组织或者线虫中配制质量浓度分别为20.0ng/mL、100.0ng/mL和1000.0ng/mL的样品，注入LC‑MS/MS，用外标法测定组织或者线虫中的ATP、ADP、AMP、CP以及creatine含量；所述LC‑MS/MS的液相条件为：thermo C18色谱柱；流动相A：乙腈:1mM醋酸铵水溶液＝100：1，流动相B：1mM醋酸铵水溶液；流速：0.3mL/min；进样盘温度：4℃；柱温：35℃；进样量：10ul；流动相梯度如表1所示，前述1mM醋酸铵水溶液的pH＝10；所述LC‑MS/MS的质谱条件为：采用选择离子监测模式扫描，以负离子模式进行检测，利用ESI电喷雾离子源，负离子喷雾电压为2500V，雾化温度100℃，离子传输毛细管温度为350℃，以氩气作为Q2碰撞气为，压力为1.5mTorr，扫描宽度选择0.002m/z，扫描时间选择0.100s。表1.梯度洗脱条件