[发明专利]粘多糖贮积症II型动物模型的构建方法及应用有效
| 申请号： | 201610803487.6 | 申请日： | 2016-09-06 |
| 公开（公告）号： | CN106282231B | 公开（公告）日： | 2020-01-03 |
| 发明（设计）人： | 高恩;侯增淼;李晓颖;李敏;杨小琳;赵金礼 | 申请（专利权）人： | 陕西慧康生物科技有限责任公司 |
| 主分类号： | C12N15/85 | 分类号： | C12N15/85;A01K67/027 |
| 代理公司： | 11276 北京市浩天知识产权代理事务所(普通合伙) | 代理人： | 刘云贵;周华宁 |
| 地址： | 710054 陕西省西安市雁*** | 国省代码： | 陕西;61 |
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| 摘要： | 本发明提供了粘多糖贮积症II型动物模型的构建方法，包括针对小鼠IDS基因设计靶点，合成寡核苷酸链，合成的寡核苷酸链经退火与pUC57‑T7‑sgRNA质粒进行连接，获得sgRNA表达载体；获得小鼠受精卵；将转录好的Cas9mRNA和sgRNA混合均匀得到RNA混合物，将RNA混合物显微注射至小鼠受精卵的细胞质，随后将存活的受精卵植入雌性小鼠体内，繁殖获得F0代小鼠；提取F0代小鼠的基因组DNA，作为模板，进行PCR反应，产物经酶切，选择突变小鼠，从而确定Founder小鼠；Founder小鼠与野生型雄性小鼠交配获得F1代小鼠。本发明还提供了由该方法构建的动物模型以及该模型在研究粘多糖贮积症II型中的用途。 | ||
| 搜索关键词： | 小鼠 寡核苷酸链 小鼠受精卵 动物模型 混合物 粘多糖 构建 细胞质 合成 退火 转录 基因组DNA 表达载体 雌性小鼠 基因设计 突变小鼠 显微注射 雄性小鼠 受精卵 野生型 交配 靶点 酶切 植入 质粒 存活 繁殖 体内 研究 | ||
【主权项】：
1.一种粘多糖贮积症II型动物模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：/n(1)针对小鼠IDS基因设计靶点，合成寡核苷酸链，合成的寡核苷酸链经退火与pUC57-T7-sgRNA质粒进行连接，获得sgRNA表达载体；/n(2)获得小鼠受精卵；/n(3)将转录好的Cas9 mRNA和sgRNA混合均匀得到RNA混合物，将RNA混合物显微注射至小鼠受精卵的细胞质，随后将存活的受精卵植入雌性小鼠体内，繁殖获得F0代小鼠；/n(4)提取F0代小鼠的基因组DNA，作为模板，采用包含sgRNA作用靶点的引物，进行PCR反应，产物经酶切，选择突变小鼠，从而确定Founder小鼠；/n(5)Founder小鼠与野生型雄性小鼠交配获得F1代小鼠；/n其中，在步骤(1)中，针对小鼠X染色体含有的艾杜糖-2-硫酸酯酶基因的5号外显子的18963-18981bp核苷酸区域和18985-19005bp核苷酸区域设计靶点；/n其中，所述粘多糖贮积症II型动物模型的X染色体的艾杜糖-2-硫酸酯酶基因的核苷酸18956-18975bp缺失，其序列是AACTCCACGCCAATCTGCTT；/n其中，步骤(1)中合成如下两对寡核苷酸链：/nms Ids E5-1-sgRNA1：TAGGACAAAGCAGATTGGCG和AAACCGCCAATCTGCTTTGT；/nms Ids E5-2-sgRNA2：TAGGATGTGGCAGATGTGCCTGA和AAACTCAGGCACATCTGCCACAT。/n
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