[发明专利]一种利用含凝块的恶性胸腹水大量制备高杀伤活性TIL细胞的方法

摘要

本发明涉及一种利用含凝块的恶性胸腹水大量制备高杀伤活性TIL细胞的方法。该方法，在培养第21～28天时可收获TIL细胞(190.1±46.7)×10⁸个(n＝12)，细胞扩增达182.5±46.8倍；其中，CD3⁺细胞约占98.55％±2.24％，CD3⁺CD8⁺细胞约占76.11％±6.88％，CD3⁺CD4⁺细胞约占24.09％±6.73％，CD3⁺CD56⁺细胞约占53.36％±9.47％，而CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺Tregs细胞仅占2.87％±1.65％，对肿瘤细胞的杀伤活性可达60.57％±5.34％(4h⁵¹Cr释放法，效/靶＝40：1)；与不对凝块进行处理时相比，本发明可使收获的TIL细胞数量多出约30％。

主权项

1.一种利用含凝块的恶性胸腹水大量制备高杀伤活性TIL细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)含凝块的恶性胸腹水的收集：无菌条件下，收集含凝块的恶性胸腹水，并加入肝素，使得所述恶性胸腹水中含有所述肝素的浓度为11.0～16.5U/mL；(2)含凝块的恶性胸腹水中游离细胞与凝块的分离：将所述含凝块的恶性胸腹水进行过滤，使恶性胸腹水中的凝块与游离细胞分离，得游离细胞‑A；(3)凝块的分解与游离细胞的释放：将所述凝块置于AIM‑V完全培养基‑Ⅰ中在适宜的条件下培养3～5天，过滤，得游离细胞‑B；(4)单个核细胞的分离：将所述游离细胞‑A和所述游离细胞‑B分别移入离心管中，离心，弃去上清液；将沉淀细胞重悬，平铺于比重为1.076～1.078的Ficoll分层液上，离心；(5)单个核细胞的洗涤：收集Ficoll分层液界面上的单个核细胞，加入AIM‑V无血清培养基，混匀，离心，弃去上清液；(6)TIL细胞的定向诱导活化：用所述AIM‑V完全培养基‑Ⅰ重悬细胞，并调节细胞密度为1.5×10⁶～3.0×10⁶个/mL，在适宜的条件下培养4～6天，培养期间用所述AIM‑V完全培养基‑Ⅰ半量换液至少1次；(7)TIL细胞的优势扩增：从培养第5～7天起，用AIM‑V完全培养基‑Ⅱ重悬细胞，并调节细胞密度为1.0×10⁶～2.0×10⁶个/mL，在适宜的条件下继续培养，每日进行细胞计数并用所述AIM‑V完全培养基‑Ⅱ将细胞密度调整为1.0×10⁶～2.0×10⁶个/mL；(8)TIL细胞的收集：培养第21～28天时，收集细胞悬液，离心，用0.9％NaCl溶液洗涤，将细胞重悬于0.9％NaCl混合溶液中，备用；所述AIM‑V完全培养基‑Ⅰ含有500～1000U/mL IFN‑γ、10～100U/mL IL‑2和3％灭活血清，所述AIM‑V完全培养基‑Ⅱ含有500～2000U/mL IL‑2、100～300U/mL IFN‑γ、20～50ng/mL抗CD3单克隆抗体和3％灭活血清。