[发明专利]一种猪肺炎支原体活菌滴度测定方法

摘要

本发明提供一种猪肺炎支原体双抗体夹心ELISA活菌滴度测定方法，以解决猪肺炎支原体传统定量检测方法费时长的弊端。具体地，本发明的方法包括a包被，b封闭，c加样，d加酶标抗体，e显色，f终止和g结果判定的步骤。通过本发明实现了对猪肺炎支原体活菌滴度的测定，检测周期仅需1天，与常用的CCU计数法相比，大大缩短了生产周期，提高了生产效率；另外，本发明的特异性强，与絮状支原体、猪鼻支原体、猪滑液支原体进行ELISA检测无交叉反应；此外，本发明的重复性好，批内变异系数和批间变异系数均小于5％。

主权项

一种猪肺炎支原体活菌滴度测定方法，其特征在于包括以下步骤：a.包被：用包被液将抗P46蛋白单克隆抗体稀释，包被至96孔酶标板，4℃过夜；所述包被液为碳酸盐缓冲液；b.封闭：弃去包被液，用PBST洗涤，加入含脱脂奶粉的PBS作为封闭液，100‑250μl/孔，37℃作用0.5‑2h；所述PBST溶液为含0.05％Tween‑20的PBS溶液；c.加样：弃去封闭液，用PBST洗涤后分别加入阴性和阳性对照样品、标准品、待检样品，80‑150μl/孔，37℃孵育0.5‑2h；阴性对照样品为A26液体培养基，阳性对照样品为猪肺炎支原体菌液，标准品为标记为S1至S6的不同活菌滴度的猪肺炎支原体菌液；d.加酶标抗体：弃去阴性和阳性对照样品、标准品、待检样品，用PBST洗涤后加入稀释的酶标抗体，80‑150μl/孔，37℃孵育0.5‑2h；e.显色：弃去酶标抗体，用PBST洗涤后加入TMB底物显色液，80‑150μl/孔，室温避光反应5‑30分钟；f.终止：用2M H2SO4终止反应，20‑100μl/孔，450nm处读取吸光值；g.结果判定：如果阳性对照OD450nm值1.0～1.5，阴性对照OD450nm值≦0.20，则试验成立，接下来，以S6作为参比标准品记为1个横坐标单位，S1～S5分别记为50、25、10、5、2.5个横坐标单位，以标准品OD450nm值减去阴性对照样品OD450nm值所得到的值为纵坐标绘制标准曲线图，通过标准曲线计算，以待检样品OD450nm值‑阴性对照样品OD450nm值来得到待检样品中的猪肺炎支原体活菌滴度。