[发明专利]一种利用肽配基亲和纯化凝血因子VIII的方法

摘要

本发明公开了一种利用肽配基亲和纯化凝血因子VIII的方法，该方法选用了对人凝血因子Ⅷ的特异性的肽配基作为亲和基质，并将该特异性的肽配基固定在琼脂糖凝胶载体上，实现凝血因子Ⅷ的快速、特异、高效纯化。其中，所述肽配基为能与凝血因子VIII发生亲和反应的多肽；所述多肽为EYCPC、GCVSGCLCWEYC和RKWNCTDHEYC中的任意一种或者EYCPC、GCVSGCLCWEYC和RKWNCTDHEYC按任意比混合后得到的混合物。利用该方法得到的凝血因子VIII的得率高、比活高，可以实现凝血因子Ⅷ的规模化纯化与制备。

主权项

1.一种利用肽配基亲和纯化凝血因子VIII的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）纯化用亲和层析树脂的制备：a、肽配基溶液的配制：称取2.8‑3.2μmol肽配基溶于0.8‑2ml双蒸水中，搅拌至肽配基完全溶解，得到肽配基溶液；其中，所述的肽配基为能与凝血因子VIII发生亲和反应的多肽；所述多肽为EYCPC、GCVSGCLCWEYC和RKWNCTDHEYC中的任意一种或者EYCPC、GCVSGCLCWEYC和RKWNCTDHEYC按任意比混合后得到的混合物；b、琼脂糖凝胶预处理：量取8‑12ml保存于20%乙醇水溶液中的琼脂糖凝胶，采用过量蒸馏水对琼脂糖凝胶进行反复洗涤，除去琼脂糖凝胶表面的乙醇，得到湿琼脂糖凝胶；c、将经过步骤b处理后得到的湿琼脂糖凝胶装入离心管中，向离心管中加入20‑25ml预冷的1mM HCl，振荡混合均匀后在4℃静置8‑12min；然后在4℃3000rpm离心4‑8min，弃上清，得到沉淀；向沉淀中加入25‑35ml去离子水，振荡混合均匀后在4℃静置8‑12min；然后在4℃3000rpm离心4‑8min，弃上清，得到凝胶沉淀；向凝胶沉淀中加入0.8‑2ml步骤a配制的肽配基溶液和8‑15ml去离子水，振荡混合均匀，再加入0.8‑1.5ml 5mg/ml的碳二亚胺溶液，振荡混合均匀后在室温下100rpm反应3.5‑5h；d、反应结束后，向步骤c的反应液中加入0.5‑1ml冰乙酸，振荡混合均匀，在室温下100rpm继续反应1‑1.5h；e、反应结束后，向步骤d的反应液中加入0.8‑1.5ml含20%哌啶的二甲基甲酰胺溶液，振荡混合均匀，在室温下100rpm继续反应7‑10min，收集反应产物；f、用100‑150ml 5mmol/L pH4.4的醋酸‑醋酸钠缓冲液对步骤e得到的反应产物进行洗涤；然后再分别用含0.5M NaCl的pH8.0的0.1M Tris‑HCl溶液和含0.5M NaCl的20mM pH4.4醋酸‑醋酸钠缓冲液各20‑30ml对反应产物进行交替洗涤3次；g、将经过步骤f处理后的反应产物用100‑150ml去离子水进行洗涤，然后再用50‑100ml 20%的乙醇水溶液洗涤，洗涤结束后，即得到纯化用亲和层析树脂；将纯化用亲和层析树脂4℃保存在20%的乙醇水溶液中，备用；（2）将步骤（1）制备得到的纯化用亲和层析树脂装入凝胶过滤层析柱中，然后向凝胶过滤层析柱上加入0.02M PBS缓冲液进行洗涤处理，洗涤至流出液的pH值与0.02M PBS缓冲液相同时，停止洗涤；（3）将待纯化的血清或血浆用0.02M PBS缓冲液稀释4‑6倍，然后用蛋白纯化仪将稀释后的血清或血浆泵入凝胶过滤层析柱中，控制蛋白纯化仪恒流泵的转速为2ml/min，凝胶过滤层析柱的柱压为0.3MPa；用50ml的含0.5M NaCl的pH8.0的0.1M Tris‑HCl溶液进行洗脱，然后再用25ml含0.5M NaCl的pH2.5的50mM的甘氨酸溶液进行洗脱，采用部分收集器对洗脱液进行收集，每管收集3‑5mL，并用紫外检测设备对收集的洗脱液进行检测，出现凝血因子VIII洗脱峰的洗脱液即为凝血因子VIII粗品；（4）用pH8.8的0.1M Tris‑HCl溶液将凝血因子VIII粗品的pH值调节至pH5.0‑pH7.0之间，然后再用0.02M pH7.2的PBS缓冲液作为透析液对其进行透析处理，透析处理时透析液与凝血因子VIII粗品的体积比为10：1，每次透析时间为4h，连续透析6次；透析处理后既得到纯化的凝血因子VIII，即凝血因子VIII纯品。