[发明专利]从血浆中分离用于治疗阿尔兹海默症的混合物的方法及混合物和应用

摘要

本发明公开了一种从血浆中分离用于治疗阿尔兹海默症的混合物的方法及混合物和应用。该混合物的分离方法依次包括血浆收集、密度梯度离心、透析、一次浓缩、去高峰度蛋白、阴离子交换以及二次浓缩步骤。该混合物包括多种蛋白质和多种小分子，所述混合物的SDS‑PAGE变性胶电泳包括至少30个条带，其中在分子量大于48kD的条带中包括明显可见的7个条带，所述7个条带的分子量从小到大依次是56kD，68kD，77kD，115kD，175kD，250kD和289kD。本发明制备的该混合物可以用于预防、改善和治疗阿尔兹海默症，还可以起到增强记忆力的作用。 1

主权项

1.一种从血浆中分离用于治疗阿尔兹海默症的混合物的方法，其特征在于，依次包括如下步骤：血浆收集步骤、密度梯度离心步骤、透析步骤、一次浓缩步骤、去高峰度蛋白步骤、阴离子交换步骤以及二次浓缩步骤；

在所述密度梯度离心步骤中，将所述血浆收集步骤得到的血浆与Percoll溶液、Forcol溶液或蔗糖溶液混合，建立密度梯度并离心，之后将离心管中最上层红色部分去掉，得到密度梯度离心后产物，其中所述离心的条件为：转速为10000‑30000g，时间为2‑20h；所述Percoll溶液、Forcol溶液或蔗糖溶液的浓度为40‑60％，所述Percoll溶液、Forcol溶液或蔗糖溶液与所述血浆的体积比为(10‑15):(1‑3)；

在所述透析步骤中，将所述密度梯度离心后的产物放入透析袋或管中进行透析，透析后收集透析袋或管中的产物，作为透析产物；其中所述透析时使用的透析缓冲液为Tris‑盐酸缓冲液，磷酸缓冲液或HBS缓冲液；所述透析袋或管的孔径为0.2‑0.3nm；

在所述一次浓缩步骤中，将所述透析产物进行浓缩，得到一次浓缩后产物，其中浓缩前体积是浓缩后体积的10倍以上；

在所述去高峰度蛋白步骤中，采用去高峰度蛋白试剂盒将一次浓缩后产物中的高峰度蛋白去掉，得到去高峰度蛋白产物，其中，去掉的所述高峰度蛋白的含量是5mg/ml；

在所述阴离子交换步骤中，将所述去高峰度蛋白产物加到阴离子交换柱中，用含有200‑500mM氯化钠的Tris‑盐酸缓冲液进行梯度洗脱，当洗脱体积为15‑35ml时开始收集洗脱液，当洗脱体积为40‑85ml时停止收集洗脱液，收集得到的洗脱液为阴离子交换后产物；所述Tris‑盐酸缓冲液的浓度为100‑200mM、pH值为8.0；

在所述二次浓缩步骤中，将所述阴离子交换后产物进行浓缩，得到二次浓缩后产物即所述混合物，其中浓缩前体积是浓缩后体积的10倍以上。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

在所述血浆收集步骤中，利用抗凝管收集血液，再通过离心收集上清液，得到血浆。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，

在所述血浆收集步骤中，所述离心转速为500‑1500g，离心时间为10‑30分钟。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

所述透析步骤的所述Tris‑盐酸缓冲液的浓度为0.2‑200mM、pH值为7.0‑9.2，所述磷酸缓冲液的浓度为1.0‑500mM、pH值为6.0‑9.2，所述HBS缓冲液的浓度为0.5‑500mM、pH值为6.4‑8.4。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，

所述透析缓冲液为1mM、pH值为8的Tris盐酸缓冲液；透析时间为20‑72h，透析体积比是1:100‑1:10000。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

所述一次浓缩步骤中，所述浓缩是采用浓缩管离心的方式进行的，所述浓缩管允许1.5‑2.5KD的物质通过，所述离心时转速为2000‑4000g。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

所述去高峰度蛋白试剂盒中的洗脱缓冲液对去高峰度蛋白柱子上的一次浓缩后产物进行洗脱时得到的洗脱液，为所述去高峰度蛋白产物。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

所述二次浓缩步骤中，所述浓缩是采用浓缩管离心的方式进行的，所述浓缩管允许1.5‑2.5KD的物质通过，所述离心时转速为2000‑4000g

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述血浆来源于哺乳动物。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

所述血浆来源于人。

11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述混合物包括多种蛋白质和多种小分子，所述混合物的SDS‑PAGE变性胶电泳包括至少30个条带，其中在分子量大于48kD的条带中包括：分子量从小到大依次是56kD，68kD，77kD，115kD，175kD，250kD和289kD的条带。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述混合物的FPLC鉴定具有4个峰，对应的蛋白大小分别是：250kD，120kD，100kD和80kD。

13.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，通过蛋白质谱分析，所述混合物至少含有30个蛋白，包括白蛋白，球蛋白，角蛋白，纤维蛋白原和转运蛋白；通过小分子质谱分析，所述混合物还至少含有20个小分子。

14.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，通过蛋白质谱分析，所述混合物所含蛋白如下：

15.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，通过小分子质谱分析，所述混合物所含的小分子如下：

16.一种药物组合物，包含采用权利要求1‑15任一所述方法获得的混合物和药学上可接受的载体。

17.采用权利要求1‑15任一所述方法获得的混合物在制备预防、改善或/和治疗记忆力减退类疾病的药物中的应用。

18.权利要求16所述的药物组合物在制备预防、改善或/和治疗记忆力减退类疾病的药物中的应用。

19.根据权利要求17或18所述的应用，其特征在于，

所述记忆力减退类疾病为阿尔兹海默症。

20.采用权利要求1‑15任一所述方法获得的混合物在制备增强记忆力药物中的应用。

21.权利要求16所述的药物组合物在制备增强记忆力药物中的应用。