[发明专利]敲除Wnt3a基因的过程及其验证方法

摘要

本发明公开了敲除Wnt3a基因的过程及其验证方法，经过构建针对Wnt3a基因的Cas9慢病毒载体、HepG2细胞的培养与传代、目的细胞慢病毒感染与筛选、错配酶法验证基因敲除效率、细胞蛋白分析、CCK‑8法检测细胞增殖的步骤完成对Wnt3a基因的敲除及验证。本发明的优点在于：本发明通过首次构建Cas9双载体慢病毒系统敲除Wnt3a基因,Crispr/Cas9 是一种能够对任何物种基因组的特定位点进行精确编辑的技术，使用该技术能够进行细胞水平单基因或多基因敲除，该方法比其它基因编辑技术靶向精确性更高，RNA靶向序列和基因组序列必须完全匹配，Cas9才会对DNA进行剪切，并可实现对靶基因多个位点同时敲除，载体构建实验周期短，节省大量时间和成本，并且无物种限制。

主权项

敲除Wnt3a基因的过程及其验证方法，其特征在于：经过构建针对Wnt3a基因的Cas9慢病毒载体、HepG2细胞的培养与传代、目的细胞慢病毒感染与筛选、错配酶法验证基因敲除效率、细胞蛋白分析、CCK‑8法检测细胞增殖的步骤完成对Wnt3a基因的敲除及验证；所述构建针对Wnt3a基因的Cas9慢病毒载体的具体步骤为：构建Cas9双载体慢病毒，包含Lenti‑sgRNA‑EGFP病毒2个，分别表达靶基因sgRNA序列及对照sgRNA序列，滴度在1E+8以上； Lenti‑CAS9‑puro病毒1个，表达CAS9蛋白，带puro抗性，滴度在1E+8 以上；所述HepG2细胞的培养与传代的具体步骤包括细胞复苏和细胞传代。