[发明专利]一种基于同尾酶构建的RNAi载体及其应用

摘要

本发明公开了一种基于同尾酶构建的RNAi载体，其特征在于所述载体构建方法为：将靶向基因的目的片段导入过渡载体，构建获得可以产生发夹结构RNA的RNAi载体；本发明方法利用同尾酶的特性，只需要通过一次PCR扩增获得一段DNA片段，对该片段酶切一次，可以简化构建流程，提高构建效率。同时，该方法构建的RNAi载体中形成发夹结构(目的片段‑内含子‑反向重复目的片段)的部分只需要两个同尾酶酶切位点，这样可以预留出更多的单克隆位点，提高载体构建的灵活性。利用本方法构建的RNAi载体可被广泛用于多个物种基因的功能研究、遗传改造以及分子育种等，在基础研究和农业生产上都具有十分重要的价值。

主权项

1.一种基于同尾酶构建的RNAi载体，其特征在于所述载体构建方法为：将靶向基因的目的片段导入过渡载体，构建获得可以产生发夹结构RNA的RNAi载体；/n所述过渡载体中预置一个内含子和一个终止子，内含子的5’端依次设置同尾酶酶切位点A1、B1，3’端依次设置同尾酶酶切位点B2、A2，其中A1、A2为一组同尾酶酶切位点，B1、B2为另一组同尾酶酶切位点；所述目的片段的5’端和3’端分别设置A1、B1或者A2、B2酶切位点；通过两次酶切、连接和转化反应，把目的片段分别连入内含子的5’端和3’端，形成“目的片段-内含子-反向重复目的片段-终止子”结构的DNA片段，再通过一次酶切、连接和转化反应把上述DNA片段连入预置有启动子的终载体中，或者DNA片段跟设计的启动子通过三段连接连入终载体，获得RNAi载体；所述内含子核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示；所述同尾酶为下列之一：(1)BglII和BamHI，(2)NheI和XbaI，(3)SalI和XhoI；所述终载体为双元载体pCambia1300-pZmUbi-G10；所述目的基因为水稻OsTEL基因或玉米Ms45基因。/n