[发明专利]生产亚麻酸的圆红冬孢酵母及其制备方法

摘要

本发明公开一种生产α‑亚麻酸的圆红冬孢酵母及其制备方法。本发明通过从多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)胞内克隆得到活性较高的Δ15脱饱和酶基因，连接至经过改造的植物双元表达载体pCAMBIA1300，转化到根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens LBA4404)胞内并通过共培养将Δ15脱饱和酶基因结合至圆红冬孢酵母的基因组上，实现多形汉逊酵母Δ15脱饱和酶在圆红冬孢酵母胞内的过表达，从而增加α‑亚麻酸在圆红冬孢酵母胞内的产量。

主权项

1.一种圆红冬孢酵母菌株的制备方法，其特征在于，包括将SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列引入圆红冬孢酵母菌株，从而使所述圆红冬孢酵母菌株过表达具有活性的多形汉逊酵母Δ15脱饱和酶的步骤；具体包括如下步骤：(1)构建多形汉逊酵母Δ15脱饱和酶基因表达载体，其中，所述多形汉逊酵母Δ15脱饱和酶表达载体包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；所述多形汉逊酵母Δ15脱饱和酶表达载体还包含潮霉素抗性基因表达元件，所述潮霉素抗性基因表达元件由圆红冬孢酵母3‑磷酸甘油醛脱氢酶GPD基因的启动子、潮霉素抗性基因和CaMV终止子组成；(2)利用多形汉逊酵母Δ15脱饱和酶表达载体转化根癌农杆菌以形成转化的根癌农杆菌；(3)将转化的根癌农杆菌与圆红冬孢酵母共培养，从而将多形汉逊酵母Δ15脱饱和酶基因转化至所述圆红冬孢酵母；在步骤(1)中，采用pCAMBIA1300载体构建多形汉逊酵母Δ15脱饱和酶基因表达载体，将圆红冬孢酵母的保守基因3‑磷酸甘油醛脱氢酶GPD基因的SEQ ID NO:1所示的启动子和SEQ ID NO:3所示的终止子序列与多形汉逊酵母Δ15脱饱和酶的SEQ ID NO:2所示的开放阅读框连接在一起组成多形汉逊酵母Δ15脱饱和酶FAD15表达元件，用EcoRI和BamHI双酶切连接的方法将多形汉逊酵母Δ15脱饱和酶FAD15表达元件连接在pCAMBIA1300载体上；将圆红冬孢酵母3‑磷酸甘油醛脱氢酶GPD基因的启动子与SEQ ID NO:10所示的潮霉素抗性基因开放阅读框连接在一起组成潮霉素抗性基因表达元件，终止子用pCAMBIA1300载体自身携带的CaMV终止子，用XhoI和BstxI双酶切将潮霉素抗性基因表达元件连接到pCAMBIA1300载体上。