[发明专利]一种含草莓ARF4点突变基因的过表达载体的构建方法

摘要

本发明提供一种含草莓ARF4点突变基因的过表达载体的构建方法其主要特征是，草莓ARF4基因上有miR390靶标ta‑siRNA3的作用位点，能被ta‑siRNA3切割而失去功能，利用快速定点突变技术对ARF4基因进行改造，获得ta‑siRNA3靶标消除但所翻译氨基酸序列不变的ARF4基因过表达载体，再结合转基因技术对ARF4进行功能分析。从‘艳丽’草莓叶片提取RNA，反转录为cDNA，设计引物并利用PCR技术获得ARF4基因的ORF全长，将其进行定点突变，获得突变序列，之后插入pRI101‑AN载体，最终获得草莓ARF4点突变基因的植物过表达载体。其优点是，介绍了草莓ARF4基因克隆及定点突变方法，首次报道了草莓ARF4基因的ORF全长，所构建的草莓ARF4基因过表达载体将为深入分析其功能和作用机制，丰富植物ARF4基因的相关研究奠定重要基础。

主权项

一种含草莓ARF4点突变基因的过表达载体的构建方法，包括草莓ARF4基因的DNA序列如序列表中‘艳丽’草莓ARF4基因序列，草莓ARF4点突变基因的DNA 序列如序列表中‘艳丽’草莓点突变ARF4基因的序列，其特征是，草莓ARF4基因的克隆方法如下：1）以草莓幼嫩叶片为材料，利用CTAB法提取总RNA，反转录合成cDNA，设计特定引物扩增草莓ARF4基因：上游引物 ARF4‑F：5'‑ CGCCATATGATGGAATTTGATCTGA‑3'；下游引物 ARF4‑R：5'‑GCGTCGACTCAGACCCTAATTGCTG‑3'；2）以反转录的cDNA为模板，进行聚合酶链式PCR反应，产物连接到pGM‑T载体，转化TOP10感受态细胞，进行序列测定，得到序列如序列表中‘艳丽’草莓ARF4基因序列所示。