[发明专利]一种检测红肉苹果花青苷降低猪卵巢颗粒细胞内活性氧的方法

摘要

本发明涉及一种检测红肉苹果花青苷降低猪卵巢颗粒细胞内活性氧的方法。按如下步骤操作：用丙酮浸提出红肉苹果中的花青苷，抽滤，滤液旋转蒸发至丙酮除尽，剩余液体用滤膜过滤后，4℃保存备用；体外培养猪卵巢颗粒细胞；用不同体积分数的红肉苹果花青苷和活性氧阳性对照试剂Rosup刺激猪卵巢颗粒细胞F1代6小时；给细胞装载荧光探针DCFH‑DA，收集细胞后用流式细胞仪检测。本发明方法原理可靠，操作简单，结果显示，红肉苹果花青苷能降低细胞内的活性氧水平，且随着浓度的增加效果越明显。

主权项

1.一种检测红肉苹果花青苷降低猪卵巢颗粒细胞内活性氧的方法，其特征在于按照如下步骤操作：第一步，红肉苹果花青苷样品的制备：取红肉苹果为原料，洗净后沥干，削皮，将皮用液氮研磨成粉；将得到的苹果皮粉末置于锥形瓶中，按固液比1:10加入丙酮溶液；将锥形瓶用封口膜封口，置于超声波清洗器中，控制温度在30℃，超声30min后置于黑暗中浸提10小时，得浸提液；将浸提液用连接真空抽气泵的布氏漏斗抽滤；将所得滤液倒入旋蒸瓶，在旋转蒸发仪上以20‑30℃旋蒸以去除丙酮溶剂；避光静置；抽滤，滤纸上的颗粒即为花青苷粗品；将带有花青苷粗品的滤纸于‑70℃预冷，后放入真空冷冻干燥机内冻干至少12小时；称取0.0090g所得的花青苷粗品，加4.5mL二甲基亚砜DMSO稀释，用0.22μm滤膜过滤后用锡箔纸包裹，4℃避光保存待用；第二步，猪卵巢颗粒细胞的培养：采集母猪形态健康没有排卵的卵巢，用75％的酒精清洗卵巢表面，随后用37℃生理盐水洗三遍，后放入生理盐水中，置于水浴锅上37℃保温；使用注射器抽取直径大于3mm的卵泡于离心管中，37℃自然沉降后，弃掉上层卵泡液，吸取剩下的白色沉淀，移至离心管中，离心，弃掉上清和上层红色血细胞，加入磷酸盐缓冲液PBS，将底部细胞沉淀吹打均匀，离心，弃掉上清和上层红色血细胞，再加PBS，重复洗一遍；而后，将细胞沉淀接种到加有10mL含有10％胎牛血清FBS及100IU青霉素和链霉素的M199培养液的10cm贴壁培养皿中，放入37℃、5％CO2、100％湿度的培养箱里培养；在细胞培养24小时时更换新的培养液，继续放入37℃、5％CO2、100％湿度的培养箱里培养，此时细胞组织块都已贴壁；在细胞培养72小时时，弃掉原代培养培养皿中的培养液，每个培养皿中加入胰酶细胞消化液TE，放入37℃、5％CO2、100％湿度的培养箱里孵育3‑5min，待细胞组织块消化，将细胞吹打下来，转入离心管，离心；弃上清，将细胞接种到24孔板中，每孔加有1mL培养液且每孔接种的细胞数为1×105个，放入37℃、5％CO2、100％湿度的培养箱里静置12小时后待用；第三步，用红肉苹果花青苷刺激细胞：将静置12小时后的猪卵巢颗粒细胞，更换新培养液，用红肉苹果花青苷刺激细胞，按照实验设计，2个空白对照孔，2个阴性对照孔，2个阳性对照孔，2个加0.5μL体积分数1/2000的红肉苹果花青苷孔，2个加1.5μL体积分数3/2000的红肉苹果花青苷孔，2个加5μL体积分数1/200的红肉苹果花青苷孔，未加花青苷或加花青苷不足5μL的加DMSO补齐，加完药品，放入培养箱中处理6小时；所述培养液为含有10％FBS及100IU青霉素和链霉素的M199培养液；第四步，原位装载探针：按照体积比1:2000用无血清的M199培养液稀释2'7'‑二乙酰二氯荧光素DCFH‑DA，使终浓度为5μM/L，将处理6小时的颗粒细胞，去除培养液，每孔加入500μL稀释好的DCFH‑DA探针溶液，空白对照组不加；阳性对照组和三个加花青苷处理组都加入2.5μLRosup，其它组用水补齐，放入培养箱孵育半小时；第五步，检测：将装载完探针的细胞取出，弃上清，每孔加500μL TE，放入培养箱孵育5min，将细胞吹打下来，转移到对应标记的离心管中，过细胞筛后用流式细胞仪检测。