[发明专利]一种低分子肝素基本组成单元的亲水相互作用色谱多反应监测二级质谱联用检测方法

摘要

本发明涉及一种低分子肝素完全降解产物的亲水相互作用色谱与多反应监测二级质谱联用检测方法，本发明通过对依诺肝素钠的还原端进行还原，并利用双氧水进行水解的方法对依诺肝素钠的原还原端及非还原端进行鉴定。利用亲水相互作用色谱与多反应监测二级质谱对所有组成单元进行定量分析，特别是对含量较低的特殊结构进行定量，对低分子肝素进行表征。

主权项

1.一种低分子肝素完全降解产物的亲水相互作用色谱与多反应监测二级质谱联用检测方法，其特征在于，步骤如下：(1)将醋酸铵试剂溶解于去离子水，制得醋酸铵浓度为3～10mM的流动相A；(2)将醋酸铵试剂溶解于去离子水，并加入乙腈，制得流动相B，流动相B中，醋酸铵的浓度为3～10mM，乙腈的体积百分比为90～98％；(3)将依诺肝素钠标准品用肝素酶I、II和III在25℃条件下降解48h，将加入内标的降解产物用Millipore 30KDa的超滤膜过滤后真空减压干燥；(4)如果需要区分低分子肝素末端结构，则将10～50μg加入内标的低分子肝素酶解产物样品经硼氢化钠还原10～12h，并使用双氧水进行水解，将加入内标的低分子肝素酶解产物样品的水解产物配置成浓度为1～10μg/μL的待测溶液，进入步骤(5)；如果不需要区分低分子肝素末端结构，则将10～50μg加入内标的低分子肝素酶解产物样品直接配制为浓度为1～10μg/μL的待测溶液，进入步骤(5)；(5)对步骤(4)得到的待测溶液离心处理，离心后，使用亲水相互作用色谱柱进行分离：流速0.1～0.5mL/min，洗脱梯度如下，均为体积百分比：0～5min，5％流动相A，95％流动相B；5～107min，5～23％流动相A，95～77％流动相B；107～112min，23～50％流动相A，77～50％流动相B；112～125min，50％流动相A，50％流动相B；(6)在正离子模式或负离子模式下用多反应监测二级质谱仪进行检测；所述步骤(5)中的质谱采用三重四极杆质谱仪(TSQ)，设定参数为：正离子模式喷雾电压：+4.0kV；负离子模式喷雾电压：‑3.2kV；鞘流气：20～30arb；管状透镜电压：±50～150V；碰撞能：20‑50。