[发明专利]矮牵牛叶肉原生质体分离及培养方法

摘要

本发明公开了一种矮牵牛叶肉原生质体分离及培养方法，所述原生质体分离方法包括以下步骤：称量矮牵牛幼嫩叶片进行处理后用酶解液酶解；向酶解后的溶液中加入CPW洗液，经过滤、离心，吸去上清液；再次加入CPW洗液洗涤，离心，收集沉淀，即得纯化后的原生质体。所述原生质体培养方法包括：将制备的原生质体加入原生质体培养液中，24℃黑暗环境固液培养法培养30d后，将培养形成的微型愈伤组织转移至增殖培养基；培养21d后，转移至分化培养基；培养即可。用本发明的分离及培养方法可获得高活性、高产量的原生质体，对其培养可诱导出愈伤组织，最终分化出芽，为矮牵牛进一步体细胞融合等研究提供实验材料，可为矮牵牛种质资源创新奠定基础。

主权项

1.一种矮牵牛叶肉原生质体分离方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：A、称量矮牵牛幼嫩叶片，依次经肥皂水浸泡、流水冲洗、75wt％酒精浸泡、1wt％双氧水消毒、无菌水冲洗后，吸干水分，切成细丝；B、用酶解液酶解步骤A处理后的叶片；所述酶解液的溶剂为水溶液，溶质为如下终浓度的物质：2wt％纤维素酶、0.4wt％离析酶、0.2wt％果胶酶、0.5M甘露醇、0.11wt％CaCl2、0.10wt％牛血清白蛋白、20mM MES；所述酶解液的PH为5.6～5.7；C、向步骤B酶解后的溶液中加入CPW洗液，经300目细胞筛过滤后1100r/min离心2min，吸去上清液；所述CPW洗液的溶剂为CPW盐溶液，溶质为终浓度0.5M的甘露醇；D、再次加入CPW洗液洗涤，1100r/min离心2min，吸去上清液，收集沉淀，即得纯化后的原生质体；步骤A中，所述幼嫩叶片为顶芽下端第3～5片幼嫩叶片；所述矮牵牛为矮牵牛锦浪系列Petunia hybrida‘Shock Wave’白色花品种；所述离心采用的离心机型号为Centrifuge 5810R离心机，离心时将升降加速度均设为0。