[发明专利]基于超支化纳米复合物的双酚A增敏型免疫层析金标试纸条的制备方法

摘要

本发明公开了一种基于超支化纳米复合物的双酚A增敏型免疫层析金标试纸条的制备方法，属于免疫学检测技术领域。本发明试纸条由样品垫、金标垫、包被膜和吸水膜依次粘贴组合到PVC底板上，其中，金标垫上涂覆有超支化纳米复合物增敏探针，包被膜上具有检测线和质控线，检测线上包被有双酚A包被抗原，质控线上包被有羊抗鼠IgG。本发明试纸条的制备方法包括超支化纳米复合物增敏探针的制备、金标垫的制备、包被膜的制备以及试纸条的组装等。本发明试纸条利用超支化金标抗体增敏探针代替常规的金标抗体，极大提高检测灵敏度，且操作简单、检测速度快，不需要专用仪器设备，成本低廉，非常适合于基层检验检疫工作中大批量样品中双酚A的快速检测。

主权项

1.一种基于超支化纳米复合物的双酚A增敏型免疫层析金标试纸条的制备方法，其特征在于具体制备步骤如下：（1）超支化纳米复合物增敏探针的制备取浓度为1mg/mL的抗双酚A单克隆抗体溶液5mL和4mg N‑羟基琥珀酰亚胺（NHS）溶于1mL DMF中，加入5mg 碳二亚胺（EDC），室温下搅拌反应过夜，离心去沉淀，收集上清液，得到活化后的抗体溶液；取粒径为10‑15nm的胶体金溶液，用0.1M的K2CO3调节胶体金溶液的pH值为8.0‑9.0，得到胶体金溶液；取具有氨基/巯基双功能团的超支化聚合物0.5‑1 mg溶解于5mL 0.01M的PBS溶液中，在冰水浴下，将活化后的抗体溶液缓慢滴加到超支化聚合物溶液中，4℃反应过夜，得到超支化‑抗体复合物溶液；将1mL胶体金溶液稀释到5mL纯水中，在氮气保护下，逐滴滴加到超支化—抗体复合物溶液中，磁力搅拌下室温反应12h，再逐滴加入1%的BSA溶液继续搅拌30min，10000rpm 4℃离心30min，弃上清，用纯水洗涤沉淀物，离心洗涤并重复3次后将沉淀用PBS缓冲液重悬，得到超支化金标抗体免疫复合物，使得氨基/巯基双功能团超支化聚合物，通过氨基与抗体偶联，通过巯基与金纳米粒子偶联；（2）超支化纳米复合物增敏探针金标垫的制备将超支化金标抗体免疫复合物均匀的喷涂到玻璃纤维膜上，喷液量为0.7uL/cm，得到超支化纳米复合物增敏探针金标结合垫；（3）包被膜的制备将浓度为1mg/mL的双酚A—牛血清白蛋白偶联物溶液均匀的喷涂到硝酸纤维素膜上，得到检测线；将浓度为0.5‑1mg/mL的羊抗鼠IgG溶液均匀的喷涂到硝酸纤维素膜上，得到质控线；（4）基于超支化纳米复合物增敏探针免疫层析金标试纸条的制备将样品垫、超支化纳米复合物金标结合垫、具有检测线和质控线的硝酸纤维素膜和吸水垫依次粘贴组合到PVC底板上，相邻粘贴物之间的重叠部分长度为2mm，用切割机切成3mm宽的试纸条，得到基于超支化纳米复合物的增敏型双酚A免疫层析金标试纸条，与干燥剂一起装于铝箔袋中密封保存。