[发明专利]一种基于金银核壳结构拉曼增强效应的金黄色葡萄球菌肠毒素B免疫检测方法

摘要

一种基于金银核壳结构拉曼增强效应的金黄色葡萄球菌肠毒素B免疫检测方法，属于免疫分析技术领域。包括：具有强拉曼增强效应的金银核壳结构的合成，检测肠毒素B的免疫分析方法的建立。以对硝基苯硫酚（4‑NTP）修饰15 nm金纳米粒子，用柠檬酸在金纳米粒子表面还原硝酸银形成9nm的银壳，从而得到内嵌拉曼信标4‑NTP的金银核壳结构。该结构本身具有很强的拉曼增强效应，且拉曼信号稳定均一，不易丢失。在金银核壳纳米粒子上标记肠毒素B单抗，微孔板上预先包被金黄色葡萄球菌肠毒素B的捕获抗体。样品中的肠毒素B首先被微孔板上的抗体捕获，再与金银核壳纳米粒子标记的抗体结合，板上的拉曼信号通过拉曼光谱仪扫描得到。本方法肠毒素B的检测限0.002ng/mL，显著低于传统的酶联免疫方法。

主权项

一种基于金银核壳结构拉曼增强效应的金黄色葡萄球菌肠毒素B的免疫检测方法，其特征在于：首先以对硝基苯硫酚4‑NTP修饰15 nm金纳米粒子，用柠檬酸在金纳米粒子表面还原硝酸银形成9nm的银壳，从而得到内嵌拉曼信标4‑NTP的金银核壳结构，其具有强拉曼信号的、区别于微孔板本底信号的金银核壳纳米粒子；金银核壳纳米粒子标记肠毒素B单克隆抗体，并应用于金黄色葡萄球菌肠毒素B的免疫检测；具体步骤为：（1）金银核壳纳米粒子的合成：采用柠檬酸还原法合成15nm金纳米粒子Au NP，通过金巯键与信标分子4‑NTP进行偶联：取5mL合成的金纳米粒子8000rpm离心15min，用1mL 10mM 磷酸盐缓冲液PB重悬；加入25μL 200μM的对硝基苯硫酚4‑NTP，室温避光反应6‑8h；然后8000rpm离心15 min，加入600μL超纯水和300μL质量体积比为10% 的聚乙烯吡咯烷酮；再加入120μL 2mM AgNO₃和100μL 0.1M的柠檬酸三钠，迅速震荡后室温静置10 min；8500rpm离心15 min后，弃去上清，用1mL 10mM PB重悬合成金银核壳纳米粒子；对金银核壳纳米粒子的银壳厚度、拉曼信号通过投射电镜和拉曼光谱仪进行表征；（2）金银核壳纳米粒子标记肠毒素B单克隆抗体：1mL步骤（1）制备的金银核壳纳米粒子中加入终浓度为10μg/mL的金黄色葡萄球菌肠毒素B单克隆抗体1F6，加入8μL 0.2 M Na₂CO₃调节pH到7.5，室温震荡反应2h；向体系中加入50μL 20mg/mL的BSA，室温震荡反应2h；8500rpm离心15min后完成金银核壳纳米粒子的标记肠毒素B单克隆抗体；（3）金黄色葡萄球菌肠毒素B免疫检测：a、将终浓度为5μg/mL、0.01M碳酸盐缓冲液为溶剂的金黄色葡萄球菌肠毒素包被抗体K3加入到微孔板中，加入量为100μL/孔，37℃孵育2h；b、用10mM PBS、0.1% Tween 20的洗液洗步骤a所得微孔板3次，每次间隔3min；加入封闭液，即质量浓度为0.2%明胶，溶剂为0.01M碳酸盐缓冲液，37℃孵育2h；c、用10mM PBS、0.1% Tween 20的洗液洗步骤b所得微孔板3次，每次间隔3min；按100μL/孔加入金黄色葡萄球菌肠毒素B样品到微孔板中，37℃反应1h；d、用10mM PBS、0.1% Tween 20的洗液洗步骤c所得微孔板3次，每次间隔3min；加入步骤（2）制备的金银核壳纳米粒子标记的金黄色葡萄球菌肠毒素B单克隆抗体1F6，加入量为100μL/孔，37℃反应1h；e、用10mM PBS、0.1%Tween 20的洗液洗步骤d所得微孔板4次，每次间隔3min；最后一次洗板后用吸水纸排干微孔板，然后用拉曼光谱仪扫描样品信号，得到检测结果。