[发明专利]一种基于RNAi的转基因西瓜新材料创制

摘要

本发明涉及一种RNA干涉载体构建方法及及其在西瓜遗传转化中的应用，涉及植物病毒防治技术领域，属于生物和现代农业技术领域的应用技术。通过作用寄主因子，破坏其介导病毒侵染功能，使西瓜获得抗病毒活性，目前尚未有报道。本发明构建RNA干涉载体，并遗传转化西瓜，其特征在于克隆西瓜eIF4E及其同源异构体eIF(iso)4E基因，连接后分别得到4E‑iso正义和反义片段，再将其连接在内含子序列两侧，得到4E‑iso发卡结构片段；通过T4连接和同源重组分别将4E‑iso正义片段、反义片段和发卡结构片段插入pCAMBIA1301载体，得到RNA干涉载体；通过农杆菌介导将目的基因片段转化西瓜子叶外植体，筛选培育获得具有目的基因片段的转基因西瓜。本发明的主要用途是为西瓜病毒病害防治提供新材料和新技术。

主权项

RNA干涉载体构建及对西瓜子叶外植体遗传转化应用。其特征在于克隆西瓜的eIF4E基因及其同源异构体eIF(iso)4E基因，分别选取eIF4E和eIF(iso)4E基因部分片段，重叠PCR扩增得到4E‑iso正义片段和4E‑iso反义片段，插入pCAMBIA1301载体，分别构建含有正义片段的载体pC4E‑iso‑S，反义片段的载体pC4E‑iso‑A和含有发卡结构片段的干涉载体pC4E‑iso‑SA。诱导西瓜子叶外植体，将含有目的基因片段的重组RNAi载体转化农杆菌AGL‑1菌株。通过农杆菌介导法对西瓜子叶外植体进行遗传转化操作，将重组载体pC4E‑iso‑S、pC4E‑iso‑A和pC4E‑iso‑SA分别转化西瓜后，使目的基因片段插入到西瓜染色体中。插入基因片段以dsRNA的存在形式激发PTGS反应，降解与插入的目的基因片段具有同源性的西瓜eIF4E基因及其同源异构体eIF(iso)4E基因。培育转基因西瓜植株，经抗生素筛选和分子生物学鉴定，得到含西瓜eIF4E基因及其同源异构体eIF(iso)4E基因片段干涉表达载体的转基因植株。