[发明专利]一种梅片树愈伤组织的诱导与增殖方法

摘要

本发明公开了一种梅片树愈伤组织的诱导与增殖方法，是取梅片树当年生枝条或嫩叶作为外植体，进行表面消毒；然后将消毒后的外植体置于愈伤组织诱导培养基上，进行培养获得愈伤组织；再将愈伤组织置于继代增殖培养基上进行培养，获得大量的愈伤组织；最后将愈伤组织置于防褐化培养基上进行培养，获得质地疏松的淡白色和淡黄色的愈伤组织。本发明不仅能够快速诱导得到梅片树愈伤组织，且诱导率较高、所获得的梅片树愈伤组织生长旺盛，可长期继代保持，为梅片树生物技术、细胞悬浮培养和生产次生代谢产物等研究奠定了良好的基础。

主权项

一种梅片树愈伤组织的诱导与增殖方法，其特征在于包括下述步骤：(1)无菌外植体茎段或叶片的获取：选取右旋龙脑含量较高的梅片树优良植株，取其当年生枝条或嫩叶作为外植体进行消毒处理；将消毒后的嫩叶表面水分吸干，剪成1～2cm2大小的叶片；将消毒后的枝条剪成1～2cm长短的茎段；(2)梅片树愈伤组织的诱导培养：取无菌梅片树的叶片或茎段，将其以平放的方式接种到愈伤组织诱导培养基上，置于培养箱中黑暗条件下培养25～35天，得到初代愈伤组织，培养温度为25±1℃；所述愈伤组织诱导培养基的组成为下述两者之一：(a)MS培养基、4mg/L的2,4‑二氯苯氧乙酸、0.4～0.6mg/L的6‑苄氨基腺嘌呤、10～30g/L的蔗糖和7～8g/L的琼脂粉；(b)MS培养基、3mg/L的6‑苄氨基腺嘌呤、0.5～1mg/L的萘乙酸、10～30g/L的蔗糖和7～8g/L的琼脂粉；(3)梅片树愈伤组织的继代培养：将初代愈伤组织中生长旺盛、质地疏松的淡白色愈伤组织转接到继代增殖培养基中，于25±1℃、黑暗条件下培养10～20天，获得大量继代愈伤组织；所述继代增殖培养基的组成为下述两者之一：(a)MS培养基、4mg/L的2,4‑二氯苯氧乙酸、0.4～0.6mg/L的6‑苄氨基腺嘌呤、10～30g/L的蔗糖和7～8g/L的琼脂粉；(b)MS培养基、0.5～1mg/L的萘乙酸、4～5mg/L的6‑苄氨基腺嘌呤、10～30g/L的蔗糖和7～8g/L的琼脂粉；(4)梅片树愈伤组织的防褐化培养：将生长状态较好的继代愈伤组织转接到不同的防褐化培养基中，于25±1℃、黑暗条件下进行培养，10～20天转接一次；所述的防褐化培养基成分为：MS培养基、10～30g/L的蔗糖、7～8g/L的琼脂粉、3～4mg/L的6‑苄氨基腺嘌呤、0.5～1mg/L的萘乙酸和防褐添加物；所述防褐添加物为聚乙烯毗咯烷酮1.0g/L+抗坏血酸0.1g/L或者聚乙烯毗咯烷酮1.0g/L+柠檬酸0.1g/L。