[发明专利]利用原生质体不对称融合技术获得葡萄杂种植株的方法

摘要

本发明提供一种利用原生质体不对称融合技术获得葡萄杂种植株的方法，包括以下步骤：取新鲜的胚性愈伤组织加酶液酶解；原生质体分别进行IOA钝化和UV钝化，得受体原生质体和供体原生质体按1︰1混合，依次加入PEG融合诱导液、高Ca²⁺‑高pH溶液，获得融合的杂种细胞；使用KM₈P固体培养基包埋培养融合杂种细胞；将再生胚性愈伤组织颗粒依次转接至分化培养基、生根培养基上培养；当组培苗长到5‑7cm栽入炼苗室中炼苗，得到体细胞杂种植株。该方法以葡萄胚性愈伤组织为材料，利用原生质体不对称融合技术成功获得获得葡萄杂种植株，为培育葡萄新品种、增强葡萄的抗性、提高葡萄品质奠定了基础。

主权项

1.一种利用原生质体不对称融合技术获得葡萄杂种植株的方法，其特征在于包括以下操作步骤：(1)原生质体的分离和纯化：取新鲜的胚性愈伤组织加酶液，在26‑28℃、黑暗条件下，60‑70r/min振荡酶解2‑8h，然后分离纯化得到葡萄原生质体；所述酶液的配方为：2.50％纤维素酶、0.25％果胶酶、0.25％离析酶、0.40mol/L甘露醇、0.1％MES，pH 5.8；(2)原生质体的的钝化处理：(a)IOA钝化：取步骤(1)获得的原生质体使用CPW溶液悬浮，调整到原生质体密度为0.5‑1×105个/mL的悬浮液，然后加入1︰5配比的4.0mmol/L碘乙酰胺溶液钝化处理9‑11min，处理完后使用CPW溶液洗涤2‑3遍，用KM8P液体培养基悬浮，将原生质体密度调整为0.5‑1×105个/mL，得到受体原生质体；(b)UV钝化：取步骤(1)获得的原生质体使用CPW溶液悬浮，调整到原生质体密度为0.5‑1×105个/mL的悬浮液，在1250‑1350μW/cm2紫外光照强度下照射0.5‑8min，得到供体原生质体；(3)原生质体的融合：将步骤(2)(a)得到的受体原生质体和步骤(2)(b)得到的供体原生质体按1︰1体积比混合，得亲本悬浮液，加入1‑4倍亲本悬浮液体积的PEG融合诱导液，在25‑30℃下保温15‑30min，再加入2‑4倍亲本悬浮液体积的高Ca2+‑高pH溶液，混合后在25‑30℃下保温10‑15min，然后使用CPW溶液洗涤2‑3遍，离心得到融合的杂种细胞；(4)融合体细胞的培养：使用KM8P固体培养基包埋培养步骤(3)得到的融合杂种细胞，在25‑27℃、黑暗条件下静置培养，直至长出再生胚性愈伤组织颗粒；(5)再生胚性愈伤组织胚状体的诱导：将再生胚性愈伤组织颗粒转接至分化培养基上诱导胚状体，直至长出不定芽，再将不定芽转接到生根培养基上培养；(6)炼苗与移栽：当组培苗长到5‑7cm、且根系生长旺盛时，将组培苗移栽入炼苗室中进行炼苗，即得到体细胞杂种植株。