[发明专利]人乳头瘤病毒58E7蛋白表达纯化方法及应用

摘要

本发明提供一种人类乳头瘤病毒HPV-58E7蛋白的表达纯化方法，通过设计HPV-58E7的扩增引物，从HPV-58阳性细胞中有效扩增出该基因，将含不同酶切位点的HPV-58E7基因序列按照先后顺序插入到载体pGEX-4T2和pEGFP-C1中，获得重组载体，再与Glutathione-Sepharose 4B磁珠结合，切除GST标签，获取HPV-58E7蛋白，经PBS透析过夜纯化。本发明获得的人类乳头瘤病毒HPV-58E7蛋白，通过免疫动物获得血清并经过纯化获得高特异性、高效价比的多克隆抗体，可在制备多克隆抗体中应用。

主权项

人乳头瘤病毒58E7蛋白表达纯化方法，通过以下步骤实现：(1)HPV‑58E7基因的调取及扩增：设计HPV‑58E7的扩增引物，并从HPV‑58阳性人宫颈上皮细胞中有效扩增出这个基因，其中用于扩增用于原核表达的HPV‑58E7序列的上游引物序列为SEQ ID NO.1：5’‑CCGGGATCCATGAGAGGAAACAACCCAACG‑3’，划线部分为BamH Ⅰ酶切位点，下游引物序列为SEQ ID NO.2：5’‑CCGGAATTCTTATTGCTGTGCACAGCTAGG‑3’，划线部分为EcoR Ⅰ酶切位点；用于扩增用于真核表达的HPV‑58E7序列的上游引物序列为SEQ ID NO.3：5’‑CCGGAATTCATGAGAGGAAACAACCCAACGC‑3’，划线部分为EcoR Ⅰ酶切位点，下游引物序列为SEQ ID NO.4：5’‑CCGGGATCCTTATTGCTGTGCACAGCTAGG‑3’，划线部分为BamH Ⅰ酶切位点；(2)HPV‑58E7基因原核及真核表达载体的构建：将步骤(1)中得到的这两个含不同酶切位点的HPV‑58E7基因序列按照先后顺序插入到载体pGEX‑4T2和pEGFP‑C1中，获得用于后续实验的重组载体pGEX‑4T2‑(HPV‑58E7)和pEGFP‑C1‑(HPV‑58E7)；(3)GST‑(HPV‑58E7)融合蛋白的原核表达：将步骤(2)中构建的重组载体pGEX‑4T2‑(HPV‑58E7)转入大肠埃希菌DH5α，待细菌OD值介于0.6‑0.8之间，加IPTG至终浓度为0.2mM，并在26‑28℃的诱导温度下，诱导4‑6h后收集细菌，在250‑300W超声功率下，超声时间9秒，间歇时间9秒，总时长约3min以破碎细菌，收集上清；(4)GST‑(HPV‑58E7)融合蛋白的纯化及HPV‑58E7蛋白的获得：通过(3)步骤获得的上清与Glutathione‑Sepharose 4B磁珠结合，再用凝血酶切除GST标签，获取HPV‑58E7蛋白，PBS透析过夜获得纯化的HPV‑58E7蛋白。