[发明专利]一种裸鼹鼠少突胶质前体细胞培养方法

摘要

本发明涉及细胞生物学技术领域，特别涉及一种裸鼹鼠少突胶质前体细胞的分离纯化和培养方法。本发明综合使用多种培养基从裸鼹鼠胎鼠大脑皮层分离并纯化培养少突胶质前体细胞，摸索出了适于变温的啮齿类哺乳动物裸鼹鼠少突胶质前体细胞的合理培养方法。本发明方法能够简便、高效、经济的获得大量功能活性正常的裸鼹鼠少突胶质前体细胞，低氧条件下的培养能够保证这种细胞在离体环境中依然能够保持在体状态下的生物学特性，从而便于直接在纯净的体外细胞培养模型中进一步研究裸鼹鼠少突胶质前体细胞的特殊生理功能，从而为探索其中的生物学机制并应用于临床相关领域提供重要的理论依据。

主权项

1.一种裸鼹鼠少突胶质前体细胞培养方法，包括以下步骤：A、收集裸鼹鼠大脑皮层混合胶质细胞：分离出生1‑7天裸鼹鼠大脑皮层组织，将组织剪碎，加入消化液混匀之后，将其放入三气培养箱中消化；用混合神经细胞培养基终止消化，离心去除上清之后，在混合神经细胞培养基中将细胞沉淀重悬并吹打成单细胞悬液；将单细胞悬液种于包被有左旋多聚赖氨酸的培养瓶中；B、裸鼹鼠大脑皮层混合神经细胞的培养：将步骤A得到的混合神经细胞，用混合神经细胞培养基中培养于三气培养箱中25‑‑30天；自混合神经细胞接种之后，每7天采取半量换液的方法更换混合神经细胞培养基；C、裸鼹鼠少突胶质前体细胞的分离及纯化培养：将步骤B培养的混合神经细胞恒温震荡摇床中培养，恒温35±2℃，将震荡培养的细胞悬液置于未包被有左旋多聚赖氨酸的培养皿中使细胞贴壁，小心吸取上清，并将上清中的细胞种于包被有左旋多聚赖氨酸的培养皿中；待其贴壁后，用添加B104条件上清的少突胶质前体细胞增殖培养基进行纯化培养；所述的少突胶质前体细胞增殖培养基为Neurobasal和B27；所述的混合神经细胞培养基为含体积分数为15％胎牛血清的低糖DMEM；所述的三气培养箱的参数设置为：温度控制在35±2℃，氧浓度为5％，二氧化碳浓度为5±1％，湿度为96±2％；步骤C中，所述震荡培养时间为20小时；所述恒温震荡摇床转速为200rpm；恒温震荡培养过程中保持培养瓶口旋紧以减少瓶内外空气交换；步骤C中，所述B104条件上清的收集是利用神经母细胞瘤B104细胞培养于二气培养箱中，利用混合神经细胞增殖培养基进行培养，待细胞生长至80％融合度时，换为Neurobasal/B27培养基培养48小时，随后收集上清并用0.22μm滤器过滤后置于‑70℃保存备用；所述二气培养箱参数设置为：37℃，21％氧气浓度，5％二氧化碳浓度，以及96％湿度；所述混合神经细胞增殖培养基为含有体积分数为15％胎牛血清的低糖DMEM。