[发明专利]一种从凝结芽孢杆菌中提取环(甘-酪)二肽的方法

摘要

本发明公开了一种从凝结芽孢杆菌（芽孢乳酸菌）中提取环(甘‑酪)二肽的方法方法。制备环(甘‑酪)二肽方法主要包括菌种活化及培养，粗提物的获得，将粗提物经硅胶柱层析粗分，凝胶柱层析细分，并经HPLC进一步纯化，TLC跟踪检测，得到化合物经核磁检测并与文献对比鉴定为环(甘‑酪)二肽。本发明所用原料凝结芽孢杆菌是一种益生菌，安全无害，提取工艺简单，成本低；制得的化合物纯度高。

主权项

1.一种利用微生物制备环(甘‑酪)二肽的方法，环(甘‑酪)二肽的结构式如下：；其特征在于，所述方法包括以下步骤：（1）菌种活化：将凝结芽孢杆菌接种到平板培养基上，37℃条件下培养24小时，获得活化菌种；所述凝结芽孢杆菌的保藏编号为：CCTCC NO：M2013193；（2）初级培养：将步骤（1）中得到的活化菌种接种到MRS液体培养基中，在150r/min，37℃条件下，摇床培养12～16小时，得种子液；（3）次级培养：将步骤（2）得到的种子液接种到MRS液体培养基中，种子液的体积为MRS液体培养基体积的4～6%，在150r/min，37℃条件下，摇床培养48～72小时得发酵液；（4）粗提物制备：将步骤（3）制备的发酵液旋蒸浓缩至原来体积的1/4后离心，取上清液用乙醇沉淀，过滤并继续将滤液浓缩至原来体积的1/4，然后用乙酸乙酯萃取，将水相用正丁醇进行再次萃取，将正丁醇萃取液减压浓缩获得粗提物； （5）硅胶柱层析粗分：将步骤（4）制备的粗提物用甲醇溶解然后硅胶拌样后装柱，固定相为80‑100目的硅胶，以二氯甲烷：甲醇体积比=50:1～1:1梯度洗脱，硅胶薄层层析检测，收集二氯甲烷‑甲醇的体积比为10:1的流份；（6）将上述步骤（5）中得到的流份经Sephadex LH‑20凝胶柱层析洗脱，以二氯甲烷：甲醇=1:1作为流动相，并经硅胶薄层层析检测合并相同流份，获得3个流份； （7）将步骤（6）得到的第三个流份采用反相高效液相色谱纯化，减压浓缩，干燥，得环(甘‑酪)二肽；所述平板培养基的配方为：蛋白胨10.0g/L、牛肉膏10.0g/L、酵母膏5.0g/L、葡萄糖20.0g/L、乙酸钠5.0g/L、柠檬酸二铵 2.0g/L、磷酸氢二钾0.4g/L、硫酸镁0.58g/L、硫酸锰0.25g/L、琼脂15.0g/L，吐温‑80 1.0mL /L，pH 6.0；所述MRS液体培养基的配方为：蛋白胨10.0g/L、牛肉膏10.0g/L、酵母膏5.0g/L、葡萄糖20.0g/L、乙酸钠5.0g/L、柠檬酸二铵 2.0g/L、磷酸氢二钾0.4g/L、硫酸镁0.58g/L、硫酸锰0.25g/L、吐温‑80 1.0mL /L，pH 6.0；所述步骤（4）中浓缩后滤液用乙酸乙酯萃取的具体操作是：将浓缩后滤液与乙酸乙酯按体积比1︰1混合，倒入分液漏斗中，摇瓶萃取2~3次，每次静置20～30min，得到水相；乙酸乙酯萃取得到水相用正丁醇萃取的具体操作是：水相与正丁醇按体积比1︰1混合，倒入分液漏斗中，摇瓶萃取2~3次，每次静置20～30min，得到正丁醇萃取液；所述步骤（7）中的反相高效液相色谱条件为：色谱柱：安捷伦pursuit C18，10μm，150×21.2mm；流动相组成为乙腈∶水＝ 5∶95‑50∶50；流速：15ml/min；柱温：25℃；检测波长：230，254nm；进样量：300‑500μl。